Молекулярный анализ нуклеиновых кислот позволяет обнаруживать специфические нарушения в генах, оценивать их влияние на экспрессию генов и, в конечном итоге, на физиологию клетки. Аномальную (измененную или экзогенную) нуклеотидную последовательность выявляют с помощью блот-гибридизации, затем выделяют ее методами молекулярного клонирования и получают в препаративных количествах. Далее такую последовательность можно использовать для изучения белок-кодирующих участков и регуляторных областей. Изменения в регуляторных областях могут приводить к изменению уровня экспрессии соответствующих генов, а в кодирующих последовательностях — к изменению биологических свойств кодируемых ими белков. Кроме того, клонированные последовательности могут использоваться как матрицы для синтеза белков в прокариотических и эукариотических системах экспрессии.

Изучение функций этих белков позволяет определять их роль в работе клетки в норме и патологии. Влияние генетических нарушений на функционирование клетки можно изучать и путем их внесения в эндогенные копии соответствующих генов в нормальных клетках с помощью направленного переноса генов в системах in vitro или у трансгенных животных in vivo, В большинстве работ по изучению заболеваний человека используется именно такой подход. Так, вводя активированные онкогены в нормальые клетки, индуцируют опухолевый рост, а вводя в опухолевые клетки функционально активные гены—супрессоры опухолей, частично подавляют рост опухолей у животных. К числу приоритетных направлений относится также разработка методов генотерапии наследственных заболеваний с помощью направленного переноса генов.

Успех любого исследования такого рода зависит прежде всего от того, удастся ли выявить ассоциированные с данным заболеванием нарушения в определенном гене.

Выделение нуклеиновых кислот

Чтобы проводить молекулярный анализ нуклеиновых кислот, нужно прежде всего получить их в чистом виде. Если источником нуклеиновых кислот служит клинический образец, то необходимо подобрать оптимальные методы выделения, позволяющие получить максимальное количество высокочистого продукта, поскольку размер таких образцов обычно очень мал и часто их бывает сложно получить повторно. При работе с культурами клеток можно использовать более простые методы выделения, так как выход нуклеиновых кислот увеличивается пропорционально объему культуры.

Типичная диплоидная клетка человека в норме содержит примерно 7 пг геномной ДНК и разное количество митохондриаль-ной ДНК. Таким образом, суммарный продукт, выделяемый из клинических образцов, представляет собой смесь геномной и ми-тохондриальной ДНК. Получить чистую геномную ДНК можно только одним способом: выделением ядер и освобождением из них ДНК. Впрочем, в большинстве случаев эксперименты можно проводить на суммарной ДНК, поскольку митохондриальная ДНК обычно не мешает анализу.

Типичная клетка млекопитающих содержит около 15 пг РНК. Из них 80-85% приходится на долю рибосомной (28S, 18S и 5S) РНК, а остальная часть представлена в основном низкомолекулярными РНК (транспортными и малыми ядерными). И лишь 1—5% суммарной РНК составляет информационная РНК (мРНК), гетерогенная как по размеру, так и по первичной структуре. К счастью, в большинстве случаев на 3-конце мРНК эукариот находится роlу(А)-«хвост». Он может образовывать комплекс с фрагментом oligo(dT), что позволяет проводить очистку мРНК с помощью аффинной хроматографии на оligо(аТ)-целлюлозе.

В этих статьях описано несколько методов выделения ДНК и РНК. Их сможет легко освоить любой даже не очень опытный экспериментатор. Представлены методы выделения нуклеиновых кислот только из клеточного материала и свежих/замороженных тканей. Выбор конкретного метода зависит от целей эксперимента.

- Читать далее "Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК"