Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Представленный в протоколе метод является модификацией метода, описанного в статьях. Он дает хорошие результаты при работе с образцами, содержащими большие количества РНКаз, и, по-видимому, является наиболее распространенным методом выделения РНК. Гуанидинтиоцианат — очень сильный денатурирующий агент, который используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков (в том числе РНКаз). Поскольку плавучая плотность РНК (примерно 1,9 г/мл) намного выше, чем у ДНК и белков, ее можно отделить от других клеточных компонентов равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl.

Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• Буфер для гомогенизации: 4 М гуанидинтиоцианат, 100 мМ трис-HCl, рН 7,5. Перед использованием в буфер добавляют 2-меркаптоэтанол до 1% (о/о)
• Хлористый цезий: 5,7 М раствор в 10 х ТЭ
• 10 х ТЭ: 100 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0

Методика
1. Готовят образцы для выделения РНК, как это описано в протоколе.
2. Добавляют к каждому образцу по 3 мл буфера для гомогенизации и интенсивно перемешивают.
3. Набирают гомогенат в стерильный шприц для подкожных инъекций с иглой № 23 и выдавливают его обратно в пробирку.
4. Повторяют п. 3 пять раз.

выделение рнк

5. Осаждают все негомогенизированные фрагменты ткани центрифугированием при 3500 g в течение 10 мин при комнатной температуре (эту процедуру можно не проводить, если РНК выделяют из клеточной суспензии).
6. Центрифугирование в градиенте плотности можно проводить двумя способами. Если используется ротор Beckman SW41 (или его аналог), то в чистую центрифужную пробирку наливают 8 мл 5,7 М CsCl и сверху наслаивают гомогенат. Другой подход (например, если используется ротор SW55) состоит в добавлении 0,8 г CsCl на каждый миллилитр гомогената и наслаивании полученного раствора в чистой центрифужной пробирке на 1,5 мл 5,7 М CsCl. При центрифугировании ДНК будет собираться в верхней части подслаивающего раствора («подушки»), а РНК образует осадок на дне пробирки. РНК при этом будет получена в интактном виде, а фрагменты ДНК будут иметь слишком маленький размер (примерно 30 т.н.), чтобы их можно было использовать в большинстве экспериментов.
7. Центрифугируют при 200 000 g в течение 16 ч при 20 С (45 000 об/мин, если используется ротор SW55) или при 135 000 g в течение 24 ч при 20 °С (32 000 об/мин, если используется ротор SW41).
8. Отсасывают раствор до уровня «подушки». После этого при необходимости можно отобрать клеточную ДНК, образующую в верхней части подушки видимую белую полосу.
9. Осторожно, чтобы не взмутить осадок РНК, микропипеткой полностью отбирают весь оставшийся раствор.

10. Добавляют в пробирку 750 мкл этанола и переносят его вместе с осадком РНК в микроцентрифужную пробирку.
11. Центрифужную пробирку промывают 750 мкл 80% этанола и переносят его в ту же микроцентрифужную пробирку. Получаемый на этой стадии осадок РНК можно хранить под спиртом при -70 °С.
12. Центрифугируют РНК при 14 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре.
13. Отбирают супернатант, промывают осадок 80% этанолом и центрифугируют при 14 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре.

14. Отбирают супернатант и подсушивают осадок в течение 2,5 мин под вакуумом.
15. Растворяют осадок РНК в 300 мкл ТЭ, добавляют 750 мкл этанола и хранят образцы при —70 °С.
16. Водный раствор РНК получают.
- Альтернативный вариант. В центрифужную пробирку вносят 0,75 мл трифторацетата цезия (СsТФА) с плотностью 2 г/мл и наслаивают на него «подушку» из СsТФАс плотностью 1,7 г/мл. Плотность гомогената добавлением СsТФА доводят до 1,4 г/мл и наслаивают его на «подушку» из СsТФА. После центрифугирования РНК и ДНК собираются соответственно в верхней части первой (у дна) и второй «подушек». Введение в растворы СsТФА бромистого этидия до конечной концентрации 25 мкг/мл облегчает визуализацию нуклеиновых кислот, так что ДНК и РНК можно собрать шприцом с иглой, проколов стенку центрифужной пробирки на нужной высоте. Бромистый этидий удаляют из препаратов нуклеиновых кислот до их переосаждения экстракцией изобутанолом.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: