Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК

Описанный в протоколе метод представляет собой модификацию метода, предложенного в работе. Лизис клеток и расщепление клеточных белков осуществляют, как в методе с использованием протеиназы К. Однако экстракцию фенолом/хлороформом не проводят, что уменьшает вероятность механической деградации ДНК.

Выделение высокомолекулярной ДНК

Материалы
• Буфер для выделения
• РНКаза А: 20 мг/мл
• Протеиназа К: 20 мг/мл
• 10% (в/о) саркозил
• Буфер для денатурации: 80% формамид, 20 мМ трис-НС1, рН8,0

В большинстве случаев формамид высокой степени чистоты можно использовать без какой-либо предварительной обработки. Однако если формамид имеет слегка желтоватый цвет, его деионизуют в течение 30 мин в щейкере при помощи смеси катионообменной и анионообменной смол (например, Bio-Rad AG 501-XG). Ионообменную смолу после этого удаляют фильтрованием или центрифугированием при 400 g в течение 5 мин, а деионизованный формамид хранят в аликвотах при -70 °С.
• Буфер для диализа: 0,1 М ацетат натрия, 10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА
• Буфер ТЭ

выделение рнк
Методика

1. Готовят образцы тканей для выделения ДНК согласно протоколу 12.1 и проводят обработку протеиназой К.
2. Добавляют к каждому образцу 10 мл охлажденного до 4 С буфера для денатурации и очень осторожно перемешивают.
3. Инкубируют образцы 6 ч при 15 С.
4. Переносят вязкий раствор в диализный мешок (Sartorius SM 13200Е или аналогичный) и диализуют трижды против 5 л буфера для диализа.

5. Пять раз диализуют раствор против 5 л ТЭ.
6. Полученный раствор ДНК. можно сконцентрировать, поместив диализный мешок в сухие смолы для гель-фильтрации (например, в сефадекс G-50).
7. Переносят вязкий раствор ДНК в центрифужные пробирки (пробирку).
- Полученная этим методом ДНК имеет размер 200-300 т.н. и, таким образом, является хорошим исходным материалом для молекулярного клонирования в космидных векторах.

Выделение РНК

Методы выделения ДНК и РНК в принципе не различаются, варьируют лишь некоторые методологические приемы. Для выделения РНК проводят лизис клеток, депротеинизацию клеточного лизата и отделение РНК от ДНК. Однако РНК по сравнению с ДНК гораздо более лабильна и чувствительна к действию нуклеаз. Кроме того, РНКазы менее чувствительны к действию денатурирующих белки веществ, чем ДНКазы. Все это затрудняет получение полноразмерной РНК и заставляет проводить инактивацию РНКаз одновременно с лизисом. Обычно молекулы РНК имеют небольшой размер, так что можно не очень опасаться их механической деградации и интенсивно смешивать клеточный лизат с ингибиторами или инактиваторами РНКаз. Необходимо также принять все меры предосторожности для предотвращения случайного попадания РНКаз из других источников. Значительные количества РНКаз находятся на нашей коже, поэтому выделение РНК следует проводить в одноразовых резиновых перчатках. Необходимо также иметь в виду следующее (особенно если экспериментатор не слишком опытен):

• вся используемая вода должна быть обработана 0,1 % диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) при 37 С в течение ночи и затем проавтоклавирована. После такой обработки вода становится полностью свободной от РНКаз и может использоваться для приготовления растворов или для мытья всех необходимых для выделения РНК приспособлений. NB! Есть данные, что ДЭПК является канцерогеном, поэтому при работе с ним следует соблюдать все необходимые меры предосторожности;

• лучше всего использовать для выделения РНК стерильную одноразовую пластиковую посуду, поскольку на ней нет РНКаз. Обычную лабораторную стеклянную или пластиковую посуду необходимо замочить в обработанной ДЭПК воде на 2 ч при 37 °С, затем тщательно промыть в обработанной ДЭПК воде и автоклавировать;

• растворы, используемые для выделения РНК, необходимо обработать 0,1% ДЭПК при 37 °С в течение ночи и проавтоклавировать. Их также можно приготовить на обработанной ДЭПКводе. При этом надо иметь в виду, что ДЭПК активно реагирует с содержащими аминогруппы веществами и поэтому не может применяться для обработки растворов, содержащих трис. Трис-содержащие буферы нужно готовить на обработанной ДЭПК воде из специально предназначенных для молекулярной биологии препаратов триса и после приготовления автоклавировать;

• крайне желательно иметь оборудование (стеклянную и пластиковую посуду, автоматические пипетки, камеры для электрофореза и т. д.), предназначенное исключительно для работы с РНК, и выделить в лаборатории место, где не проводится никаких работ с РНКазами;

• ингибиторы РНКаз должны использоваться везде, где это возможно: в буферах для выделения РНК, при последующих экспериментах, при хранении РНК в водных растворах. Белковые ингибиторы РНКаз производятся несколькими фирмами (например, Sigma) и могут применяться в том виде, в каком они поступают; хранить и применять их необходимо в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Поскольку эти ингибиторы могут денатурировать под действием денатурирующих агентов или деградировать под действием протеаз, их использование при выделении РНК сравнительно малоэффективно;

• некоторые фирмы (например, Sigma) производят также ванадил-рибонуклеозидные комплексы. Эти комплексы, образованные ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеозидов, связываются со многими РНКазами и практически полностью их ингибируют. Комплексы добавляют к растворам для выделения и используют на всех необходимых этапах. Однако следует помнить, что они ингибируют трансляцию РНК в бесклеточной системе синтеза белка; в этих случаях их необходимо удалять из препаратов РНК многократной экстракцией фенолом.

- Читать далее "Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: