Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК

Для выделения геномной ДНК разрушают плазматическую и ядерную мембраны и освобождаются от клеточных белков. Подготовка образца для выделения описана в протоколе. Для депротеинизации используют два метода:
• обработка белков протеазами (например, протеиназой К) в присутствии ЭДТА и детергентов (например, саркозила);
• денатурация и экстракция органическими растворителями (например, фенолом и хлороформом).
Эти методы описаны соответственно в протоколах.

Из водных растворов геномную ДНК можно осадить добавлением этанола или изопропанола. В обоих случаях в конечном итоге получаются фрагменты ДНК размером 100-200 т.н., пригодные для проведения блот-гибридизации по Саузерну и клонирования в бактериофаге К. Однако для молекулярного клонирования в космидных векторах необходимы фрагменты большего размера (250—300 т.н.), так что при выделении ДНК нужно стремиться к минимальной фрагментации молекул. Конечный размер получающихся фрагментов ДНК зависит от двух основных факторов: действия клеточных нуклеаз и механического разрушения ДНК в процессе выделения. Эндогенные нуклеазы необходимо инактивировать сразу после лизиса клеток. Для этого лизат смешивают с ингибиторами нуклеаз. При этом следует иметь в виду, что если смешивание будет очень энергичным, может произойти гидродинамическая фрагментация молекул ДНК. Таким образом, образцы следует перемешивать тщательно, но осторожно. Механическое разрушение ДНК может происходить и во время экстракции органическими растворителями.

Методы, описанные в протоколах, являются модификацией метода Блина и Стаффорда. Клетки лизируют саркозилом, а белки расщепляют протеиназой К в присутствии ЭДТА.

Подготовка образцов для выделения ДНК

Материалы
• Буфер для выделения: 300 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, рН 7,5. Непосредственно перед использованием добавляют РНКазу А до конечной концентрации 25 мкг/мл
• РНКаза А: готовят раствор РНКазы (20 мг/мл) в стерильной дистиллированной воде, кипятят 10 мин (для инактивации ДНКаз) и охлаждают 5 мин во льду. Хранят при -20 °С
• Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ фосфатный буфер, 150 мM NaCl, pH7,2
• Саркозил: готовят 10% (в/о) раствор саркозила в стерильной дистиллированной воде и прогревают его при 65 С в течение как минимум 1 ч.

выделение днк

Методика
Конкретные детали методов зависят от характера образца.
A. Культивируемые клетки
1. Осаждают клетки (1—5 • 107) в полипропиленовых пробирках на 50 мл центрифугированием при 800 g в течение 7 мин при 4 °С. Монослои сначала трипсинизируют, а суспензии центрифугируют сразу.
2. Промывают клетки в 20 мл холодного ФСБ.
3. Ресуспендируют клетки в 10 мл буфера для выделения. Альтернативный вариант: ресуспендируют клетки в 1 мл буфера для выделения, быстро замораживают в жидком азоте и хранят при температуре —70 "С или ниже. ДНК выделяют добавлением 9 мл подогретого буфера для выделения, содержащего протеиназу К (110 мкг/мл) и саркозил (0,55%, в/о).

Б. Образцы ткани
1. Образцы ткани, предназначенные для выделения из них нуклеиновых кислот, должны храниться при температуре не выше -70 °С.
2. Охлаждают в сухом льду стакан из нержавеющей стали для гомогенизатора Уоринга (Patterson Scientific).
3. Измельчают в порошок примерно 5 г сухого льда.
4. Добавляют замороженную ткань и измельчают.
5. Чтобы предотвратить размораживание ткани во время измельчения, постоянно добавляют сухой лед.
6. Переносят измельченную смесь в центрифужную полипропиленовую пробирку на 50 мл и дают испариться большей части сухого льда (но не всему льду),
7. Добавляют 10 мл буфера для выделения на 1 г ткани.

B. Кровь
1. Переносят 20 мл взятой с ЭДТА крови в центрифужную полипропиленовую пробирку на 50 мл с 30 мл 37,5 мМ NaCl, pH 7,5. Тщательно перемешивают.
2. Осаждают лейкоциты центрифугированием при 800g в течение 7 мин при 4 С.
3. Отбирают супернатант (лизированные эритроциты) и промывают осадок тем же раствором.
4. Ресуспендируют клетки в 10 мл буфера для выделения. Альтернативный вариант: ресуспендируют клетки в 1 мл буфера для выделения, быстро замораживают в жидком азоте и хранят при температуре не выше -70 °С. ДНК можно выделить добавлением 9 мл подогретого буфера для выделения, содержащего протеиназу К (110 мкг/мл) и саркозил (0,55%, в/о).

- Читать далее "Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: