Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров

Обычно окрашивание проводят при температуре 60 С, хотя в случае цитологических и гистологических препаратов соответствующие реакции лучше идут при 20 С («комнатная температура»), В протоколе описан рутинный метод окрашивания метафазных пластинок, а на рисунке представлены результаты окрашивания митотических хромосом человека с помощью AgNO3.

Окрашивание серебром ЯОР на хромосомах

1. Обычным способом готовят метафазные пластинки хромосом.
2. На каждый препарат наносят 3—4 капли раствора нитрата серебра (50 г/дл в 0,03% формалине), накрывают его покровным стеклом и края заливают резиновым клеем (типа «Holdtite»).
3. Инкубируют препараты в химическом стакане, содержащем небольшое количество частично испарившейся воды, при 60 С в течение 1 ч.
4. Проверяют интенсивность окрашивания под световым микроскопом. Участки ЯОР должны выглядеть как черные точки на хромосомах.
5. Проводят стандартное окрашивание по Гимза (10% раствор Гимза в фосфатном буфере, рН 6,8).

ядрышковые организаторы

Техника окрашивания коллоидным серебром для выявления белков, ассоциированных с ЯОР и фибриллярными центрами, высокоспецифична. К счастью, этот метод может использоваться для анализа фиксированных формалином и залитых в парафин тканей (в том числе архивных материалов), а также замороженных срезов, цитологических мазков и препаратов, полученных центрифугированием. Данный метод получил общепринятое название АgЯОР; он описан в протоколе.

В нашей лаборатории с помощью этого метода мы проводим рутинное окрашивание метакрилатных срезов толщиной 1 мкм. Необходимо, однако, заметить, что при такой малой толщине теряется больше ЯОР.

Метод AgЯOP для выявления интерфазных ЯОР/фибриллярных центров

1. Обычным способом готовят парафиновые срезы толщиной 3 мкм, замороженные срезы толщиной 4 мкм или цитологические мазки. Препараты фиксируют в 100% этаноле или в 100% метаноле при комнатной температуре в течение 10 мин.

2. Смешивают в равных количествах следующие реактивы:
• желатина (2 г/дл) в водном растворе муравьиной кислоты (1 г/дл);
• водный раствор нитрата серебра (50 г/дл).

3. Заливают полученной смесью срезы и инкубируют их в течение 30-60 мин в защищенном от света месте (согласно условиям для Kodak 1 А) при комнатной температуре.
4. Тщательно промывают препараты в дважды дистиллированной и деионизованной воде.
5. При необходимости проводят контрастирование в стандартном растворе гемалюма Майера в течение 2—5 мин.
6. Дегидратируют срезы в батарее спиртов (например, в 50, 70 и 100% этаноле), промывают в ксилоле и монтируют с использованием синтетической среды (типа DPX, BDH, UK).

- Читать далее "Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: