Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции

Фоновое окрашивание может стать серьезной проблемой в следующих случаях:
• ткань содержит большие количества коллагена;
• в ткани есть крупные очаги некроза;
• используемые стеклянная и пластиковая посуда и водные растворы не являются абсолютно чистыми.

Для решения этой проблемы можно использовать два подхода: физический и основанный на химической модификации.
В первом случае фон уменьшают, создавая «барьер» между реакционной смесью и срезом или используя силу тяготения. Ниже описаны эти методы и два способа химической модификации.

а. На срез кладут смоченный в стандартном растворе для АgЯОР-реакции кусочек тонкой сетчатой найлоновой ткани и проводят операции, описанные в протоколе.
б. Обрабатывают парафиновые срезы в течение 5 мин смесью уксусной кислоты и этанола (1:3, о/о), промывают их 100% этанолом и переносят в раствор целлоидина (1 г/дл) в смеси этанола с диэтиловым эфиром (1:1, о/о), выдерживают 1 мин, сливают раствор и до отвердевания целлоидина переносят срезы в 70% этанол. Промывают срезы в чистой воде и окрашивают, как описано в протоколе,
в. Чтобы использовать для уменьшения фона силу тяготения, АgЯОР-реакцию проводят в закрытом блоке Shandon Cadenza/Sequenza (Shandon Scientific, UK), поместив срезы на предметных стеклах лицевой стороной вниз. Промывка и монтирование срезов проводятся при этом, как обычно.

окрашивание ядрышкового организатора

г. После депарафинирования срезы высушивают и помещают на 1—2 ч в стандартный реактив Шиффа. Затем промывают их в чистой воде и окрашивают AgЯOP, как описано в протоколе.
д. Заменяют в обычном методе окрашивания желатину на полиэтиленгликоль (мол. масса 20 000) в концентрации 1 мг/мл и проводят AgЯOP-peaiomio, как описано в протоколе, но с инкубацией в течение 20 мин при 40 С.

Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции

Некоторые методы фиксации отлично сочетаются с последующей АgЯОР-реакцией, тогда как другие оказываются мало совместимыми.
Механизм влияния фиксации на окрашивание неоднократно обсуждался. Так, негативный эффект фиксаторов на основе ртути можно объяснить тем, что ионы Hg2+ блокируют связывающие серебро SH- и S—S-группы. Фиксаторы на основе бихромата окисляют сульфгидрильные группы.

В результате обычной ионной реакции ионы Ag и Cl могут образовывать осадок хлорида серебра AgCl, поэтому для приготовления всех растворов и промывания срезов необходимо использовать очень чистую воду, лучше всего — очищенную электрофоретически или деионизованную дистиллированную воду.

Важно учитывать особенности методов фиксации: одни фиксаторы никак не влияют на окрашивание, другие существенно ухудшают результаты. Не исключено, что в каких-то случаях придется изменить время окрашивания.

в. Поскольку размер окрашенных серебром областей увеличивается во времени, при слишком длительном окрашивании отдельные АgЯОР-сайты могут сливаться. В результате число АgЯОР, выявленных в интерфазном ядре, может оказаться заниженным. Поэтому очень важно провести предварительное «титрование» срезов или клеточных препаратов, чтобы подобрать оптимальное время реакции.

г. Применение контрастирования определяется предпочтениями исследователя. В некоторых работах в качестве контрастирующего вещества использовали гемалюм или метиловый зеленый. Однако при такой обработке может произойти маскирование AgЯOP, и обычно при гистологических и цитологических исследованиях контрастирование вообще не применяют. В ходе реакций, использующихся в методе AgЯOP, ядра окрашиваются в оранжевый цвет, что позволяет достаточно легко определять тип клеток.

- Читать далее "Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: