Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами

Фибриллярные центры можно визуализировать с помошью обычной электронной микроскопии: на фотографиях они выглядят как электронопрозрачные области в ядрышках клеток. Кроме этого, благодаря аргирофильной природе их можно выявить ла ультраструктурном уровне, как это описано в протоколе.

Ультраструктурный метод выявления ЯОР на интерфазных хромосомах

Материалы
• 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8
• 1,2-1,8% глутаральдегид в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8
• Фиксатор Карнуа: этанол/уксусная кислота/хлороформ
• Реактивы для окрашивания
• «Ингибисол» (Taab, UK)
• Смола TAAB EM (Taab, UK)

Методика
1. Измельчают свежую ткань.
2. Фиксируют ее в 1,2—1,8% глутаральдегиде в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8, в течение 10 мин при 4 С.
3. Фиксируют в фиксаторе Карнуа в течение 5 мин при 4 С.
4. Промывают один раз в 70% этаноле и два раза в чистой воде.
5. Проводят в затемненном месте стандартную AgЯOP-peaкцию в течение 10 мин при 70 °С.

выявление ядрышкового организатора

6. Промывают несколько раз в чистой воде.
7. Дегидратируют с использованием серии спиртов возрастающей концентрации (до 100% этанола) и затем промывают два раза по 30 мин 100% этанолом.
8. Промывают два раза по 30 мин в чистом «Ингибисоле».
9. Помешают ткань на ночь в смесь «Ингибисол»: смола ТААВ ЕМ, 50:50.
10. Помешаютткань на 6 ч в смесь «Ингибисол»: смола ТААВ ЕМ, 25:75.

11. Помещают ткань на ночь в чистую смолу ТААВ ЕМ.
12. Заливают ткань смолой и проводят полимеризацию при 70 С.
13. Готовят срезы и монтируют их на сетках Cu/Rh.
14. Окрашивают срезы в течение 10 мин в растворе уранилацетат/ацетон.
15. Промывают срезы в ацетоне.
16. Окрашивают срезы в течение 10 мин в стандартном растворе цитрата, приготовленном по методу Рейнольдса.
17. Промывают срезы, высушивают и проводят микроскопию.

Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами

Альтернативный метод выявления ЯОР основан на связывании ионов висмута Bi3+ с ЯОР-ассоциированными белками с мол. массой 100 кДа (к сожалению, в нем используется токсичный и обладающий неприятным запахом сульфид аммония). По нашим данным, этот метод может быть особенно полезен в тех случаях, когда наблюдается высокая фоновая преципитация коллоидного серебра. На рисунке представлены результаты опыта по связыванию висмута с ЯОР интерфазных хромосом.

Выявление ЯОР методом, основанным на связывании висмута

Материалы
• 0,2 М трис-HCl, рН 7,6
• Раствор висмута: к 10 мл 1 М NaOH добавляют 400 мг тартрата натрия и в полученный раствор вносят 200 мг оксинитрата висмута. Добавляют 3,5 объема 0,1 М трис-HCI, рН 7,6, и доводят рН до 7,0, добавляя по каплям 10% HCI. При рН 7,0 раствор становится мутным. После фильтрования раствор можно использовать для окрашивания срезов.

Методика
1. Готовят обычным способом парафиновые срезы толщиной 3 мкм из фиксированной формалином ткани, депарафинируют их и регидратируют в чистой воде.
2. Промывают срезы в 0,2 М трис-HCI, рН 7,6.
3. Окрашивают в растворе висмута в течение 2,5 ч или более.
4. Промывают три раза по 10 мин в 0,1 М трис-HCl, рН 7,6.
5. В вытяжном шкафу промывают срезы 0,1 М трис-HCI, рН 7,6, к которому добавлено несколько капель сульфида аммония.
6. Промывают срезы в чистой воде, дегидратируют их и монтируют на предметные стекла. ЯОР выглядят как черно-коричневые точки.

- Читать далее "Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: