Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора

Гибридизация in situ была тем методом, с помощью которого с применением изотопно меченных зондов были впервые выявлены ЯОР. Однако в диагностических целях этот метод практически не применяется: он весьма трудоемкий и не имеет существенных преимуществ (за исключением потенциально более высокой чувствительности) по сравнению с более простым аргирофильным методом. Недавно для выявления на срезах генов рРНК было предложено использовать неизотопный метод детекции, при котором место связывания зонда выявляли на ультраструктурном уровне с помощью мечения золотом. Для полноты картины в протоколе описан типичный метод гибридизации с использованием радиоактивно меченных зондов.

Выявление генов рРНК методом гибридизации in situ

Материалы
• Панкреатическая РНКаза А, РНКазаТ1 (Sigma)
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Серия спиртов: 50%, 70%, 95%, 100% этанол (о/о)
• 0,7 М NaOH
• Формамид
• Меченый зонд: суммарная ДНК человека, меченная 3Н с помощью ник-трансляции
• Гибридизационный буфер: 50% формамид, 4 х SSC. Доводят рН до 7,0—7,5 с помощью 0,1 М НС1
• Эмульсия Kodak NTB-12
• 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ)

ядрышковый организатор
Методика

1.Для удаления эндогенной РНК обрабатывают пластинки митотических хромосом РНКазой А (50 мкг/мл), РНКазой Т1 (10 ЕД/мл) в растворе 1 х SSC при 37 °С в течение 1 ч.
2. Промывают препараты в двух сменах 1 х SSC при комнатной температуре, по 5 мин в каждой смене.
3. Дегидратируют препараты в серии спиртов с повышением концентрации этанола до 100% и высушивают их на воздухе.
4. Для денатурации хромосомной ДНК обрабатывают препараты в течение 3 мин при 20 С 0,7 М NaOH, регидратируют их в серии спиртов и высушивают на воздухе.

5. Растворяют меченый зонд (2-4 • 106 имп./мин) в 0,1 М NaOH и денатурируют его при 20 °С в течение 15 мин.
6. Добавляют такой объем гибридизационного буфера, чтобы радиоактивность аликвоты объемом 30 мкл составляла 60—100 • 105 имп./мин. На каждый препарат наносят 30 мкл разведенного меченого зонда, накрывают его покровным стеклом и инкубируют в атмосфере 50% формамида, 4 х SSC, рН 7,0, в течение ночи (16-20 ч) при 20 °С.
7. Промывают препараты в 1 х SSC в течение 30 мин при 20 °С и 30 мин при 60 °С.
8. Промывают препараты при 4-5 °С 5% ТХУ, а затем при 20 С последовательно 70% и 95% этанолом, высушивают на воздухе и в темноте покрывают их нагретой до 45 С жидкой эмульсией Kodak NTB-2. Проявляют, промывают и анализируют картину распределения зерен серебра.

При неоплазиях клеточные популяции разнородны, что затрудняет использование многих методов анализа. Так, в состав пимфом входят в разных соотношениях эндотелиальные клетки, фибробласты, антиген-представляющие клетки и гистиоииты, а карциномы содержат в большом количестве лимфоидные и эндотелиальные клетки. Для более точного подсчета AgЯOP в клетках разного типа, присутствующих в опухолевых срезах, могут окадаться полезными иммуногистоцитохимические методы. С их помощью можно идентифицировать (или, наоборот, исключить) какие-то типы клеток и подсчитать AgЯOP в конкретной клеточной популяции. В протоколе описан один из таких методов, а рисунок иллюстрирует его использование.

Иммуноокрашивание с последующим выявлением ЯОР

1. Используя обычные методы, готовят для проведения иммуногистохимического анализа замороженные срезы толщиной 4 мкм или парафиновые срезы толщиной 2—3 мкм.
2. Подсушивают область вокруг среза, наносят на него разведенную в 0,1 М трис-HCl, рН 7,6, в соотношении 1:5 нормальную сыворотку свиньи (козы, кролика, мыши) и инкубируют препарат при комнатной температуре в течение 10 мин.
3. Аккуратно (не промывая срез) отбирают сыворотку и вместо нее наносят антитела или антисыворотку в оптимальном разведении. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
4. Промывают в течение 5 мин при комнатной температуре в 50 мМ трис-HCl, рН 7,2,100 мМ NaCl.

5. Подсушивают область вокруг среза и наносят на него вторые, зависящие от природы первых антител, антитела, разведенные в соотношении 1:30 в 0,1 М трис-HCl, рН 7,6. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
6. Промывают в ТСБ в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Подсушивают область вокруг среза и наносят на него соответствующий (зависящий от природы первых антител)1' комплекс ЩФАЩФ, разведенный в соотношении 1:100 в ТСБ. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
8. Промывают в течение 5 мин при комнатной температуре в ТСБ.
9. Для усиления сигнала повторяют пп. 5—8 еще один или два раза (оптимальную степень усиления подбирают опытным путем).

10. Инкубируют срезы в течение 30 мин при комнатной температуре в сосуде Коплина, наполненном приготовленным так, и профильтрованным субстратом щелочной фосфатазы — нафтолом AS-BI/быстрым красным TR.
11. Промывают трижды по 5 мин при комнатной температуре в чистой воде.
12. Проводят окрашивание серебром. Время окрашивания подбирают опытным путем.
13. Монтируют срезы в водной среде.

Обычно в качестве первых антител используют моноклональные мышиные антитела. В связи с этим для последующих обработок нужны кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши и моноклональный ЩФАЩФ-комплекс. При работе с первыми поликлоиальными кроличьими антитечами можно использовать свиные антитела к иммуноглобулинам кролика и поликлональный ЩФАЩФ-комплекс. Хорошие результаты, однако, могут дать и другие методы детекции, когда продукт реакций имеет красную окраску.

Как показывает наш опыт, ЩФАЩФ-метод, когда конечный продукт имеет красный цвет, предпочтительнее метода с использованием пероксидаза-3,3'-диаминобензидина. В последнем случае конечный продукт имеет коричневый цвет и его труднее отличать от «точек» AgЯOP.

Как мы уже говорили, некоторые ассоциированные с ЯОР белки могут быть выявлены как антигены с помощью иммуноцитохимических методов. Этот способ пока не нашел диагностического применения и возможность его использования зависит от наличия соответствующих аутоантител к данным белкам. Более полную информацию об этом можно получить в обзоре.

- Читать далее "Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: