Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К

Представленный в протоколе метод является модификацией метода, описанного в работе, и может использоваться только в тех случаях, когда возможна дезинтеграция образцов тканей до отдельных клеток. Таким образом, он пригоден для выделения РНК из замороженных тканей, поскольку в этом случае додецилсульфат натрия (ДСН) и протеиназа К не могут проникнуть внутрь ткани. Кроме того, эндогенные РНКазы до протеолиза протеиназой К могут в значительной степени деградировать РНК.

Выделение РНК с использованием протеиназы К

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• Буфер для выделения: 0,15 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 0,5% нонидет Р-40, 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ), 20 мМ ванадил-рибонуклеозидные комплексы
• Буфер для протеиназы К: 200 мМ трис-ацетат, 300 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, рН 7,5, 2% (в/о) ДСН
• Раствор ДСН: готовят 10% раствор ДСН (в/о) в стерильной дистиллированной воде и прогревают его при 65 °С в течение как минимум 1 ч
• Раствор протеиназы К: 20 мг/мл
• Насыщенный буфером фенол
• Смесь хлороформ:изоамиловый спирт (24:1, о/о)
• Буфер ТЭ

выделение рнк

Методика
1. Готовят образцы для выделения РНК, как описано в протоколе 12.1.
2. После отмывания клеток в ФСБ ресуспендируют их в 1 мл ФСБ и переносят суспензию в микроцентрифужную пробирку.
3. Собирают клетки центрифугированием при 14 000 g в течение 7 с при 4 С.
4. Ресуспендируют клетки интенсивным встряхиванием в 200 мкл охлажденного во льду буфера для выделения.
5. Для выделения цитоплазматической РНК центрифугируют клеточный лизат при 14 000 g в течение 2 мин при 4 С и переносят супернатант в новую пробирку. Содержащий ядра осадок выбрасывают.

6. Добавляют к каждому образцу по 200 мкл буфера для протеиназы К, содержащего 400 мкг/мл протеиназы К.
7. Инкубируют образцы 30 мин при 37 С.
8. Добавляют к образцу равный объем смеси насыщенного буфером фенола с хлороформом : изоамиловым спиртом и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Центрифугируют образец при 14 000 g в течение 2 мин при комнатной температуре.
10. Переносят водную фазу в новую пробирку и проводят экстракцию смесью хлороформ : изоамиловый спирт при комнатной температуре в течение 5 мин.

11. Повторяют п. 10 еще раз.
12. Переносят водную фазу в новую пробирку и добавляют к образцу 2,5 объема этанола.
13. Для образования осадка РНК помещают пробирку в сухой лед на 30 мин.
14. Собирают РНК центрифугированием при 14 000 g в течение 10 мин при 4 °С, затем промывают осадок РНК 700 мкл 80% этанола.
15. Высушивают осадок под вакуумом в течение 2,5 мин, растворяют его в 300 мкл ТЭ и добавляют 750 мкл этанола. 16.Хранят полученные образцы при —70 С. 17.
Для получения РНК переносят аликвоту спиртового раствора в микроцентрифужную пробирку и добавляют 3 М ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М. 18.Тщательно перемешивают и инкубируют раствор при —70 °С в течение 15 мин.

19. Осадок РНК собирают центрифугированием при 14 000 g в течение 10 мин при 4 С.
20. Промывают осадок 80% этанолом, высушивают его под вакуумом и растворяют РНК в ТЭ.
- При выделении суммарной РНК п. 5 можно опустить. После добавления протеиназы К набирают лизат в шприц с иглой № 23 и выдавливают его обратно в пробирку. Повторяют эту операцию пять раз. После обработки протеиназой К добавляют 200 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 600 мкл насыщенного водой (вместо насыщенного буфером) фенола. Экстрагируют РНК перемешиванием в течение 5 мин при комнатной температуре, центрифугируют образец при 14 000 g в течение 2 мин, переносят водную фазу в свежую пробирку и переходят к следующему этапу.
11. Пропорция образец : насыщенный буфером фенол : хлороформ : изо-амиловый спирт — 50:25 : 24: 1.

- Читать далее "Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом"

Оглавление темы "Исследование ядрышкового организотора. Выделение нуклеиновых кислот":
1. Окрашивание серебром ядрышкового организатора. Окрашивание фибриллярных центров
2. Фоновое окрашивание ядрышкового организатора. Совместимость фиксации и AgЯОР-реакции
3. Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора. Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
4. Гибридизация in situ ядрышкового организатора. Иммуногистоцитохимические методы выявления ядрышкового организатора
5. Определение ядрышковых организаторов на интерфазных хромосомах. Выявление ядрышковых организаторов в гистопатологии
6. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот
7. Выделение ДНК. Подготовка образцов для выделения ДНК
8. Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение РНК
9. Выделение РНК с использованием протеиназы К. Техника выделения РНК с протеиназой К
10. Выделение РНК с помощью гуанидинтиоцианата. Техника выделения РНК с гуанидинтиоцианатом

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: