Цель демаскирования — повысить проницаемость клеточных мембран и доступность мРНК-мишени для зонда при сохранении морфологии ткани, целостности среза и минимальных потерях РНК. Этот этап очень важен для получения хороших результатов гибридизации, так что концентрацию демаскирующих агентов и время их действия необходимо подбирать опытным путем для каждой комбинации зонд/мишень. Оптимальные условия, обеспечивающие достижение столь разных целей, зависят от типа ткани, толщины среза, способа и продолжительности фиксации, типа и размера зонда.

Если препарат фиксируют с помощью агентов, образующих большое число ковалентных сшивок (типа глутаральдегида), то в дальнейшем необходимо провести интенсивное демаскирование, а после преципитирующей фиксации дополнительная протеолитическая обработка может вообще не потребоваться.

Чаще всего для демаскирования используют пепсин или протеиназу К. Мы считаем, что для архивных биоптатов (которые обычно фиксированы формалином и залиты в парафин) и препаратов таких тканей и органов, как желудок, лимфатические узлы, гланды, мозг, оптимальной является инкубация в 0,1% (в/о) пепсине-НСl в течение 20 мин при 37 °С. Но в случае тканей молочной железы такая обработка может приводить к излишнему демаскированию.

Для обработки фиксированных параформальдегидом тканей мы обычно используем протеиназу К и после протеолитического демаскирования дополнительно фиксируем срезы в параформальдегиде для уменьшения потерь РНК.

Зонды неизотопной гибридизация мРНК

В опытах по гибридизации in situ с мРНК применяют зонды нескольких типов.
а. Двухцепочечные кДНК или геномные ДНК: их можно использовать при гибридизации как с ДНК, так и с РНК. Зонды этого типа образуют сети с молекулами-мишенями, что в принципе должно приводить к усилению гибридизационного сигнала, однако на практике в результате ассоциации в растворе такие зонды плохо проникают в ткань и лишь малая их часть гибридизуется с мРНК-мишенью. Для мечения двухцепочечных ДНК-зондов используют методы никтрансляции, рассеянной затравки и полимеразную цепную реакцию.
б. Одноцепочечные ДНК: эти зонды, как и любые другие одноцепочечные молекулы, гибридизуются только с одной цепью молекулы-мишени, так что комплементарная цепь может служить идеальным отрицательным контролем (она имеет те же GC-содержание и длину).

в. Синтетические олигонуклеотидные зонды: очень ценны для дифференциального выявления высокогомологичных последовательностей или в тех случаях, когда кДНК не клонирована или полностью не секвенирована. Такие зонды легче других проникают в ткань, но их не удается пометить до достаточно высокого уровня. Чтобы компенсировать низкий уровень мечения, часто используют смеси из большого числа (до 15) олигонуклеотидов.
г. Комплементарные одноцепочечные антисмысловые РНК-зонды (рибо-зонды): они считаются наиболее удобными при ГИС с мРНК. Их можно пометить до высокого уровня, они образуют с РНК комплексы с высокой Тт, не содержат векторных последовательностей, которые могли бы гибридизоваться с клеточными нуклеиновыми кислотами. Однако по сравнению с ДНК-зондами рибо-зонды дают более высокий неспецифический фон, который, впрочем, можно существенно снизить, обработав препарат после гибридизации РНКазой, гидролизуюшей несвязавшийся (одноцепочечный) РНК-зонд. Для мечения рибо-зондов биотином или дигоксигенином используется метод транскрипции in vitro.

Как показывает наш опыт, для неизотопной ГИС с мРНК, содержащейся в архивных препаратах, наиболее приемлемыми зондами являются РНК и олигонуклеотиды.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."