Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Цель демаскирования — повысить проницаемость клеточных мембран и доступность мРНК-мишени для зонда при сохранении морфологии ткани, целостности среза и минимальных потерях РНК. Этот этап очень важен для получения хороших результатов гибридизации, так что концентрацию демаскирующих агентов и время их действия необходимо подбирать опытным путем для каждой комбинации зонд/мишень. Оптимальные условия, обеспечивающие достижение столь разных целей, зависят от типа ткани, толщины среза, способа и продолжительности фиксации, типа и размера зонда.

Если препарат фиксируют с помощью агентов, образующих большое число ковалентных сшивок (типа глутаральдегида), то в дальнейшем необходимо провести интенсивное демаскирование, а после преципитирующей фиксации дополнительная протеолитическая обработка может вообще не потребоваться.

Чаще всего для демаскирования используют пепсин или протеиназу К. Мы считаем, что для архивных биоптатов (которые обычно фиксированы формалином и залиты в парафин) и препаратов таких тканей и органов, как желудок, лимфатические узлы, гланды, мозг, оптимальной является инкубация в 0,1% (в/о) пепсине-НСl в течение 20 мин при 37 °С. Но в случае тканей молочной железы такая обработка может приводить к излишнему демаскированию.

Для обработки фиксированных параформальдегидом тканей мы обычно используем протеиназу К и после протеолитического демаскирования дополнительно фиксируем срезы в параформальдегиде для уменьшения потерь РНК.

демаскирование нуклеиновых кислот

Зонды неизотопной гибридизация мРНК

В опытах по гибридизации in situ с мРНК применяют зонды нескольких типов.
а. Двухцепочечные кДНК или геномные ДНК: их можно использовать при гибридизации как с ДНК, так и с РНК. Зонды этого типа образуют сети с молекулами-мишенями, что в принципе должно приводить к усилению гибридизационного сигнала, однако на практике в результате ассоциации в растворе такие зонды плохо проникают в ткань и лишь малая их часть гибридизуется с мРНК-мишенью. Для мечения двухцепочечных ДНК-зондов используют методы никтрансляции, рассеянной затравки и полимеразную цепную реакцию.
б. Одноцепочечные ДНК: эти зонды, как и любые другие одноцепочечные молекулы, гибридизуются только с одной цепью молекулы-мишени, так что комплементарная цепь может служить идеальным отрицательным контролем (она имеет те же GC-содержание и длину).

в. Синтетические олигонуклеотидные зонды: очень ценны для дифференциального выявления высокогомологичных последовательностей или в тех случаях, когда кДНК не клонирована или полностью не секвенирована. Такие зонды легче других проникают в ткань, но их не удается пометить до достаточно высокого уровня. Чтобы компенсировать низкий уровень мечения, часто используют смеси из большого числа (до 15) олигонуклеотидов.
г. Комплементарные одноцепочечные антисмысловые РНК-зонды (рибо-зонды): они считаются наиболее удобными при ГИС с мРНК. Их можно пометить до высокого уровня, они образуют с РНК комплексы с высокой Тт, не содержат векторных последовательностей, которые могли бы гибридизоваться с клеточными нуклеиновыми кислотами. Однако по сравнению с ДНК-зондами рибо-зонды дают более высокий неспецифический фон, который, впрочем, можно существенно снизить, обработав препарат после гибридизации РНКазой, гидролизуюшей несвязавшийся (одноцепочечный) РНК-зонд. Для мечения рибо-зондов биотином или дигоксигенином используется метод транскрипции in vitro.

Как показывает наш опыт, для неизотопной ГИС с мРНК, содержащейся в архивных препаратах, наиболее приемлемыми зондами являются РНК и олигонуклеотиды.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: