Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК

Информационная (матричная) РНК (мРНК) служит посредником при переносе генетической информации от геномной ДНК к функционально активному полипептиду. Регуляция экспрессии генов в клетке путем активации и инактивации транскрипции осуществляется с помощью специфических сигналов и белков. Метод неизотопной гибридизации in situ (НГИС) позволяет выявить и точно локализовать в клетках или срезах тканей нуклеиновые кислоты с определенной последовательностью, а также провести полуколичественный анализ РНК-тран-скриптов одновременно с определением морфологического, биохимического и иммунологического фенотипов клеточного окружения.

В результате удается получить ценную информацию о пространственном распределении мРНК на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях и проследить за изменением ее содержания при различных патологических состояниях и в процессе развития организма. При наличии аллель-специфичных зондов можно также провести качественный анализ распределения в клетках высокогомологичных мРНК.

Пока метод НГИС используется в основном в чисто научных целях, однако с повышением доступности специфических зондов и автоматизацией процедур масштабы его применения в обычных диагностических лабораториях в диагностических и прогностических целях будут расширяться. Недавно разработанные методы выявления мРНК в фиксированных формалином и залитых в парафин архивных препаратах позволят устанавливать корреляцию между экспрессией индивидуальных генов и развитием клинической картины заболевания, а также проводить ретроспективные исследования архивных препаратов.

Для внедрения любого нового метода в клиническую практику необходимо провести предварительные эксперименты с использованием модельных и контрольных систем. Очень удобными системами такого рода являются клеточные линии. Они обладают следующими преимуществами:
• клеточные линии обычно хорошо охарактеризованы и число копий специфических мРНК в клетке либо точно известно, либо может быть определено с помощью Нозерн-блоттинга;
• экспрессию мРНК легко индуцировать или подавить с помощью различных физических воздействий, гормонов, факторов роста;
• клеточные линии достаточно (хотя и не полностью) однородны по составу;
• они являются неограниченным источником материала со стабильными свойствами.

гибридизация мрнк

Клеточные линии используются:
а) как модели при разработке методики эксперимента: на них до начала работы с клиническими препаратами можно подобрать оптимальные условия для НГИС;
б) для оценки чувствительности НГИС; при этом абсолютное количество РНК определяют с помощью Нозерн- или дот-гибридизации;

в) как положительный контроль, который гарантирует, что метод НГИС «работает» стабильно, а не от случая к случаю, и позволяет добиться необходимой чувствительности;
г) как отрицательный контроль: использование не экспрессирующей определенный ген клеточной линии позволяет убедиться в специфичности зонда.

Препарат культивируемых клеток обрабатывают так же, как клинические препараты тканей. Например, при сравнении с архивными препаратами клетки фиксируют, заливают в парафин и получают срезы. Однако вследствие различий между тканями разных типов и межклеточным материалом получить идентичные условия демаскирования и протеолитической обработки срезов не удается, так что переносить результаты, полученные на клеточных культурах, на ткани (или результаты, полученные на одной ткани, на другую ткань) следует с осторожностью.

- Читать далее "Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: