Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК

Размер зонда, образующегося при транскрипции, влияет как на способность его проникать в клетку, так и на эффективность гибридизации с последовательностями мРНК, находящимися в комплексе с рибосомами и ковалентно сшитыми с клеточным матриксом. В случае клеток, фиксированных параформальдегидом, можно использовать зонды разного размера. Это согласуется с данными о том, что при фиксации клеток и тканей параформальдегидом образуется сравнительно небольшое число ковалентных сшивок и сохраняется высокая проницаемость ткани. Достаточно хорошие результаты получаются при размере зонда от 100 до 400 нуклеотидов. Зонд длиной более 500 нуклеотидов необходимо подвергнуть ограниченному щелочному гидролизу, чтобы уменьшить его размер до 150—200 нуклеотидов.

Необходимо исключить попадание в ткань РНКазы. Этот фермент в больших количествах присутствует на коже человека, поэтому все манипуляции следует проводить в перчатках. По возможности для приготовления препаратов нужно использовать стерильные ножи, посуду и реактивы. Ткани должны быть как можно более свежими, время между получением препарата и началом его обработки не должно превышать 30 мин. Если препарат имеет большие размеры, его необходимо разрезать на кусочки (примерно 1 х 1 х 0,5 см), чтобы облегчить проникновение в ткань фиксирующих растворов.

Первым этапом в проведении гибридизации in situ является фиксация ткани, цитологического препарата или культуры клеток. Фиксация не должна нарушать морфологию ткани, в то же время необходимо заботиться о максимальном доступе к мРНК гибридизаиион-ного зонда в достаточно жестких условиях. Для гибридизации in situ используют такие фиксаторы, как параформальдегид, глутараль-дегид, забуференный формамид, раствор Боуэна, этанол/уксусную кислоту. Мы предпочитаем работать с 4% параформальдегидом, сохраняющим морфологию ткани и не мешающим гибридизации. Для приготовления фиксатора параформальдегид (твердый порошкообразный формальдегид) растворяют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при температуре не более 56 С в течении 60—90 мин.

Свежеприготовленный фиксатор необходимо использовать как можно быстрее, поскольку при хранении параформальдегид распадается с образованием нескольких соединений (в том числе муравьиной кислоты, ухудшающей сохранность мРНК в тканях). Время фиксации определяется типом ткани и составляет 30 мин для цитологических препаратов, 2 ч для эндоскопических биоптатов и 4 ч для образцов, полученных при хирургических операциях или аутопсии. При чрезмерной фиксации тканей происходит маскирование мРНК и тем самым ослабляется гибридизационный сигнал. После фиксации ткань промывают в 2—3 сменах 15% сахарозы в ФСБ, замораживают или заливают в парафиновые блоки. При оптимальном сохранении морфологии залитых в парафин препаратов степень гибридизации в них может быть ниже, чем в срезах замороженной ткани, поэтому мы рекомендуем использовать для получения срезов криостатные блоки. Их можно хранить при -80 С, но наилучшие результаты дает приготовление срезов в пределах 2 нед после фиксации.

Предварительная обработка предметных стекол, во-первых, снижает неспецифичное связывание с ними радиоактивно меченного зонда и, во-вторых, повышает сохранность срезов и самих стекол при работе. В разных лабораториях применяют разные методы очистки предметных стекол и их последующей обработки, а для некоторых тканей подбор условий для обеспечения их нормальной адгезии с предметным стеклом представляет достаточно серьезную проблему. Мы рекомендуем покрывать стекла поли-L-лизином (ПЛЛ).

зонды мрнк

Очистка предметных стекол и их обработка поли-L-лизином

1. Промывают матовые с одного конца предметные стекла в течение 20 мин в 1 М HCI.
2. Ополаскивают в деионизованной воде.
3. Заливают на 20 мин 100% этанолом.
4. Высушивают при комнатной температуре и автоклавируют для полного удаления следов рибонуклеаз.
5. Перед получением срезов покрывают стекла ПЛЛ (мол. масса 150—30 000) и используют их в первые 24 ч после обработки.

Получение криостатных срезов и цитологических препаратов

А. Получение криостатных срезов
1. Делают срезы толщиной 15 мкм и монтируют их на предварительно подготовленных предметных стеклах.
2. Предметные стекла помещают в чистый держатель.
3. Накрывают держатель фольгой и инкубируют при 37 С в течение ночи.
4. Срезы используют на следующий день или хранят их при -80 С до 12мес.

Б. Цитологические препараты
1. Суспензию клеток (106 клетка/мл) собирают на покрытых ПЛЛ предметных стеклах центрифугированием.
2. Подсушивают предметные стекла в течение 5 мин и фиксируют в 4% параформальдегиде в течение 30 мин.
3. Промывают стекла 2 раза по 30 мин в двух сменах 15% (в/о) сахарозы на фосфатно-солевом буфере (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,2, 150 мМ NaCl), высушивают их при 37 С и хранят при комнатной температуре.

- Читать далее "Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: