Прежде чем проводить гибридизацию in situ, исследуемый препарат необходимо подвергнуть соответствующей обработке. Такая обработка необходима для того, чтобы повысить доступность последовательности-мишени для зонда. Большинство описанных здесь методов направлено на повышение проницаемости фиксированного белкового клеточного материала и состоит в использовании протеазы, кислот и детергентов. Обработка другого рода имеет своей целью снижение фонового окрашивания и основана на использовании ингибиторов неспецифического окрашивания нуклеиновых кислот, в частности на предгибридизации с уксусным ангидридом и формамидом.

Предгибридизационная обработка клеток и тканей

Материалы
• ФСБ
• Протеиназа К (например, Boehringer Mannheim)
• 100мМтрис-НС1,рН8,0, 50мМЭДТА
• 4% параформальдегид в ФСБ
• 0,25% уксусный ангидрид, 0,1 М триэтаноламин, рН 8,0 (для 32Р-зондов)
• 10 мМ иодацетамид
• 10 мМ N-этилмалеимид
• Деионизованный формамид
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат Na, рН 7,0

Методика
1. Регидратируют препарат в ФСБ в течение 5 мин.
2. Погружают в ФСБ, содержащий 0,1 М глицин, на 5 мин, затем в ФСБ, содержащий 0,3% тритон Х-100, на 10 мин.
3. Промывают в двух сменах ФСБ в течение 3 мин.
4. Инкубируют при 37 °С в течение 30 мин с протеиназой К (1 мкг/мл), разведенной в буфере 100 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ ЭДТА. Этот этап очень важен, и возможно, понадобится изменить концентрацию протеиназы и время инкубации, оптимизировав их для данного препарата.
5. Проводят постфиксацию в 4% параформальдегиде, приготовленном в ФСБ, в течение 4 мин.
6. Промывают в двух сменах ФСБ, по 3 мин в каждой смене.
7. Погружают на 10 мин в 0,25% уксусный ангидрид, 0,1 М три-этаноламин, рН 8,0, если работают с 32Р-зондами. При работе с S-зондами препараты обрабатывают в течение 30 мин смесью 10 мМ иодацетамида и 10 мМ N-этилмалеимида, чтобы уменьшить неспецифическое связывание зонда.
8. Проводят предгибридизацию при 37 °С в течение по крайней мере 15 мин с 50% формамидом, 2 х SSC, рН 7.0.

Гибридизация мРНК с кРНК-зондами

Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы обеспечить доступ зонда к последовательности-мишени, необходимую жесткость условий и сохранность тканей.

Материалы
Все реагенты должны быть приготовлены на воде, обработанной ДЭПК.
• Деионизованный формамид
• 100 х раствор Денхардта: 2% (в/о) БСА, 2% (в/о) фиколл-400, 2% (в/о) поливинилпирролидин 360
• ДНК спермы лосося: 10мг/мл, фрагментированаавтоклавиро-ванием или с помощью ультразвука
• 50% (в/о) декстансульфат в ДЭПК-обработанной воде

• Гибридизационный буфер: 50% деионизованный формамид, 5 х раствор Денхардта, 10% декстрансульфат, 0,5% пирофосфат натрия, 0,5% ДСН. ДНК спермы лосося денатурируют кипячением в течение 10 мин и добавляют в буфер перед гибридизацией до конечной концентрации 250 мкг/мл. При работе с 355-зондами добавляют ДТТ до конечной концентрации 100 мМ
• Радиоактивный РНК-зонд
• Гибридизационная смесь: 9 объемов гибридизационного буфера и 1 объем раствора, содержащего кРНК-зонд в концентрации, достаточной для достижения активности (0,5—1) • 106 имп./мин на срез. Если это нужно, перед добавлением в гибридизационную смесь зонд разбавляют в ДЭПК-воде
• Покровные стекла, покрытые диметилхлорсиланом

Методика
1. Слегка подсушивают стекла (не пересушивая!)
2. Наносят 20 мкл гибридизационной смеси, предварительно прогретой при 37 °С.
3. Накрывают срез покровным стеклом, покрытым диметилхлорсиланом.
4. Инкубируют во влажной атмосфере при 37—43 °С в течение 16 ч (или в течение ночи).

- Читать далее "Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК"