Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами

Прежде чем проводить гибридизацию in situ, исследуемый препарат необходимо подвергнуть соответствующей обработке. Такая обработка необходима для того, чтобы повысить доступность последовательности-мишени для зонда. Большинство описанных здесь методов направлено на повышение проницаемости фиксированного белкового клеточного материала и состоит в использовании протеазы, кислот и детергентов. Обработка другого рода имеет своей целью снижение фонового окрашивания и основана на использовании ингибиторов неспецифического окрашивания нуклеиновых кислот, в частности на предгибридизации с уксусным ангидридом и формамидом.

Предгибридизационная обработка клеток и тканей

Материалы
• ФСБ
• Протеиназа К (например, Boehringer Mannheim)
• 100мМтрис-НС1,рН8,0, 50мМЭДТА
• 4% параформальдегид в ФСБ
• 0,25% уксусный ангидрид, 0,1 М триэтаноламин, рН 8,0 (для 32Р-зондов)
• 10 мМ иодацетамид
• 10 мМ N-этилмалеимид
• Деионизованный формамид
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат Na, рН 7,0

обработка клеток и тканей

Методика
1. Регидратируют препарат в ФСБ в течение 5 мин.
2. Погружают в ФСБ, содержащий 0,1 М глицин, на 5 мин, затем в ФСБ, содержащий 0,3% тритон Х-100, на 10 мин.
3. Промывают в двух сменах ФСБ в течение 3 мин.
4. Инкубируют при 37 °С в течение 30 мин с протеиназой К (1 мкг/мл), разведенной в буфере 100 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ ЭДТА. Этот этап очень важен, и возможно, понадобится изменить концентрацию протеиназы и время инкубации, оптимизировав их для данного препарата.
5. Проводят постфиксацию в 4% параформальдегиде, приготовленном в ФСБ, в течение 4 мин.
6. Промывают в двух сменах ФСБ, по 3 мин в каждой смене.
7. Погружают на 10 мин в 0,25% уксусный ангидрид, 0,1 М три-этаноламин, рН 8,0, если работают с 32Р-зондами. При работе с S-зондами препараты обрабатывают в течение 30 мин смесью 10 мМ иодацетамида и 10 мМ N-этилмалеимида, чтобы уменьшить неспецифическое связывание зонда.
8. Проводят предгибридизацию при 37 °С в течение по крайней мере 15 мин с 50% формамидом, 2 х SSC, рН 7.0.

Гибридизация мРНК с кРНК-зондами

Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы обеспечить доступ зонда к последовательности-мишени, необходимую жесткость условий и сохранность тканей.

Материалы
Все реагенты должны быть приготовлены на воде, обработанной ДЭПК.
• Деионизованный формамид
• 100 х раствор Денхардта: 2% (в/о) БСА, 2% (в/о) фиколл-400, 2% (в/о) поливинилпирролидин 360
• ДНК спермы лосося: 10мг/мл, фрагментированаавтоклавиро-ванием или с помощью ультразвука
• 50% (в/о) декстансульфат в ДЭПК-обработанной воде

• Гибридизационный буфер: 50% деионизованный формамид, 5 х раствор Денхардта, 10% декстрансульфат, 0,5% пирофосфат натрия, 0,5% ДСН. ДНК спермы лосося денатурируют кипячением в течение 10 мин и добавляют в буфер перед гибридизацией до конечной концентрации 250 мкг/мл. При работе с 355-зондами добавляют ДТТ до конечной концентрации 100 мМ
• Радиоактивный РНК-зонд
• Гибридизационная смесь: 9 объемов гибридизационного буфера и 1 объем раствора, содержащего кРНК-зонд в концентрации, достаточной для достижения активности (0,5—1) • 106 имп./мин на срез. Если это нужно, перед добавлением в гибридизационную смесь зонд разбавляют в ДЭПК-воде
• Покровные стекла, покрытые диметилхлорсиланом

Методика
1. Слегка подсушивают стекла (не пересушивая!)
2. Наносят 20 мкл гибридизационной смеси, предварительно прогретой при 37 °С.
3. Накрывают срез покровным стеклом, покрытым диметилхлорсиланом.
4. Инкубируют во влажной атмосфере при 37—43 °С в течение 16 ч (или в течение ночи).

- Читать далее "Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: