Предварительная обработка вымытых стекол поли-L-лизином или аминоалкилсиланами, прогревание на предметных стеклах парафинированных срезов улучшает прилипание к ним клеток и срезов тканей и предотвращает потерю материала во время гибридизации и отмывания. Для гибридизации можно использовать разные образцы: клеточные культуры; клетки, содержащиеся в смывах и аспиратах; клетки, полученные при механическом разрушении ткани; криостатные и парафиновые срезы. На стеклянные предметные стекла клетки наносят с помощью мазков или центрифугирования либо нарашивают их на стеклах в виде монослоя.

Чтобы обеспечить максимальную сохранность и минимальную деградацию нуклеиновых кислот, анализируемые образцы необходимо быстро зафиксировать или заморозить. Если этого не сделать, происходит ослабление гибридизационного сигнала независимо от продолжительности фиксации. При ГИС можно использовать разные методы фиксации: фиксацию замороженных срезов, перфузионную и иммерсионную фиксацию, заливку в парафин.

Наилучшие результаты обычно лают фиксаторы на основе альдегидов, образующих ковалентные сшивки. Во многих случаях оптимальным является 4% забуференный параформальдегид: его можно использовать для перфузии экспериментальных животных, фиксации культивированных клеток, мазков, криостатных срезов (их погружают в фиксирующий раствор на 10 мин) и биоптатов (их фиксируют в течение 2 ч). Можно применять и блоки тканей, фиксированные по общепринятой методике в 10% забуференном формалине. При слишком сильной фиксации иногда приходится проводить более интенсивную ферментативную обработку препарата, что может привести к нарушению морфологии ткани или отслаиванию среза.

Некоторые авторы рекомендуют использовать прецилитирующие фиксаторы на основе спиртов (типа фиксатора Карнуа или метанола/уксусной кислоты), не образующие сшивок между нуклеиновыми кислотами и белками. Однако, как показывает наш опыт, при этом утрачивается слишком много мРНК. и нарушается морфология клеток.

Подготовка и фиксация препаратов монослойных клеточных культур, мазков и криостатных срезов

• Раствор трипсин/ЭДТА (Gibco, UK)
• Многокомпонентная среда: среда RPMI 1640, содержащая 2 мМ L-глутамин (Gibco, UK), пенициллин/стрептомицин, 100 мкг/мл (Gibco, UK), 10% сыворотку плода коровы. Среда может храниться при 4 °С до 2 нед
• Стерильные, покрытые органосиланами предметные стекла с большим числом ячеек
• Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl на обработанной ДЭПК воде, рН 7,2-7,4
• Забуференный 4% (в/о) параформальдегид: 4 г параформальдегида (BDH, UK) растворяют в нагретом до 90—100 С ФСБ при аккуратном помешивании; всю процедуру проводят в вытяжном шкафу. Перед использованием раствор охлаждают во льду до температуры ниже 10 °С
• Глицин

1. Сливают среду и суспендируют клетки, залив их при 37 "С на 2 мин 5 мл раствора трипсин/ЭДТА (из расчета на сосуд для культивирования с площадью 80 см2).
2. Переливают суспензию в квадратную чашку Петри со стерильными, покрытыми органосиланом предметными стеклами с большим числом ячеек, разводят ее 10 мл свежеприготовленной многокомпонентной среды и помещают чашку на 37 С для адгезии клеток на предметных стеклах.
3. После 4—12 ч инкубации проверяют качество адгезии, вынимают стекла из чашек Петри и промывают их в стерильном ФСБ.
4. Свежеприготовленные мазки, криостатные срезы толщиной 6—8 мкм и клетки после адгезии на предметных стеклах фиксируют в течение 10 мин в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в ФСБ.
5. Погружают стекла в 0,2% (в/о) глицин в ФСБ на 5 мин и ополаскивают их в ФСБ.
6. Проводят демаскирование или высушивают стекла при комнатной температуре и хранят их при -20 С.

- Читать далее "Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК"