Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК

Предварительная обработка вымытых стекол поли-L-лизином или аминоалкилсиланами, прогревание на предметных стеклах парафинированных срезов улучшает прилипание к ним клеток и срезов тканей и предотвращает потерю материала во время гибридизации и отмывания. Для гибридизации можно использовать разные образцы: клеточные культуры; клетки, содержащиеся в смывах и аспиратах; клетки, полученные при механическом разрушении ткани; криостатные и парафиновые срезы. На стеклянные предметные стекла клетки наносят с помощью мазков или центрифугирования либо нарашивают их на стеклах в виде монослоя.

Чтобы обеспечить максимальную сохранность и минимальную деградацию нуклеиновых кислот, анализируемые образцы необходимо быстро зафиксировать или заморозить. Если этого не сделать, происходит ослабление гибридизационного сигнала независимо от продолжительности фиксации. При ГИС можно использовать разные методы фиксации: фиксацию замороженных срезов, перфузионную и иммерсионную фиксацию, заливку в парафин.

Наилучшие результаты обычно лают фиксаторы на основе альдегидов, образующих ковалентные сшивки. Во многих случаях оптимальным является 4% забуференный параформальдегид: его можно использовать для перфузии экспериментальных животных, фиксации культивированных клеток, мазков, криостатных срезов (их погружают в фиксирующий раствор на 10 мин) и биоптатов (их фиксируют в течение 2 ч). Можно применять и блоки тканей, фиксированные по общепринятой методике в 10% забуференном формалине. При слишком сильной фиксации иногда приходится проводить более интенсивную ферментативную обработку препарата, что может привести к нарушению морфологии ткани или отслаиванию среза.

Некоторые авторы рекомендуют использовать прецилитирующие фиксаторы на основе спиртов (типа фиксатора Карнуа или метанола/уксусной кислоты), не образующие сшивок между нуклеиновыми кислотами и белками. Однако, как показывает наш опыт, при этом утрачивается слишком много мРНК. и нарушается морфология клеток.

неизотопная гибридизация мрнк

Подготовка и фиксация препаратов монослойных клеточных культур, мазков и криостатных срезов

Материалы

• Раствор трипсин/ЭДТА (Gibco, UK)
• Многокомпонентная среда: среда RPMI 1640, содержащая 2 мМ L-глутамин (Gibco, UK), пенициллин/стрептомицин, 100 мкг/мл (Gibco, UK), 10% сыворотку плода коровы. Среда может храниться при 4 °С до 2 нед
• Стерильные, покрытые органосиланами предметные стекла с большим числом ячеек
• Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl на обработанной ДЭПК воде, рН 7,2-7,4
• Забуференный 4% (в/о) параформальдегид: 4 г параформальдегида (BDH, UK) растворяют в нагретом до 90—100 С ФСБ при аккуратном помешивании; всю процедуру проводят в вытяжном шкафу. Перед использованием раствор охлаждают во льду до температуры ниже 10 °С
• Глицин

Методика

1. Сливают среду и суспендируют клетки, залив их при 37 "С на 2 мин 5 мл раствора трипсин/ЭДТА (из расчета на сосуд для культивирования с площадью 80 см2).
2. Переливают суспензию в квадратную чашку Петри со стерильными, покрытыми органосиланом предметными стеклами с большим числом ячеек, разводят ее 10 мл свежеприготовленной многокомпонентной среды и помещают чашку на 37 С для адгезии клеток на предметных стеклах.
3. После 4—12 ч инкубации проверяют качество адгезии, вынимают стекла из чашек Петри и промывают их в стерильном ФСБ.
4. Свежеприготовленные мазки, криостатные срезы толщиной 6—8 мкм и клетки после адгезии на предметных стеклах фиксируют в течение 10 мин в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в ФСБ.
5. Погружают стекла в 0,2% (в/о) глицин в ФСБ на 5 мин и ополаскивают их в ФСБ.
6. Проводят демаскирование или высушивают стекла при комнатной температуре и хранят их при -20 С.

- Читать далее "Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: