Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК

Контроль специфичности гибридизации гарантирует, что наблюдаемый радиоавтографический сигнал появляется в результате специфического взаимодействия нуклеиновых кислот. К числу неспецифических взаимодействий относятся краевые эффекты и прилипание зонда к определенным типам тканей, а к числу слабоспецифических — связывание зонда с рибосомной РНК и с родственными мишени последовательностями. Вклад этих взаимодействий в суммарный гибридизационный сигнал можно оценить, проведя гибридизацию дополнительных срезов ткани с неродственными зондами или со смысловыми зондами.

Специфичность гибридизации можно оценить, зная предполагаемую температуру плавления гибридов между зондом и мишенью. Специфический сигнал не будет изменяться при повышении жесткости условий гибридизации, тогда как при неспецифическом или слабом связывании при повышении температуры гибриды будут диссоциировать.

Убедиться в том, что гибридизационный сигнал связан со специфическим взаимодействием зонда и РНК, позволяет предварительная обработка срезов РНКазой. Полное исчезновение сигнала при такой обработке указывает на то, что зонд связывается только с расщепляемыми РНКазой нуклеиновыми кислотами. Для проведения такого контроля срезы перед предгибридизацией в течение 30 мин обрабатывают РНКазой (20 мкг/мл), а затем проводят гибридизацию, как это описано в протоколе.

Этот контроль является наименее количественным и наиболее важным. При ГИС необходимо быть уверенным в том, что радиоавтографический сигнал соответствует известным анатомическим структурам. При этом сигналы в клетках определенного типа должны отражать распределение этих клеток в ткани, а соседние, гистологически отличающиеся клетки по возможности вообще не должны давать гибридизационный сигнал.

гибридизация мрнк

Комбинирование гибридизации in situ с другими методами позволяет расширить возможности контроля специфичности гибридизации. Имея серийные срезы, можно использовать гистохимические методы, например окрашивание иммунопероксидазой.

В этом случае приходится тщательно контролировать множество разных параметров: толщину срезов, сохранность нуклеиновых кислот, постоянство условий гибридизации и проявления, толщину и однородность эмульсии, доступность стандартных тканей, возможность построения стандартных кривых. Однако в любом случае «количественная» ГИС на самом деле может быть только полуколичественным методом.

Интерпретация данных анализа мРНК

Интерпретация данных, полученных при ГИС, представляет собой весьма непростую задачу. В первую очередь нужно убедиться в специфичности наблюдаемого радиоавтографического сигнала. Например, некоторые связанные с воспалительными процессами клетки (эозинофилы, макрофаги) неспецифически связывают зонды (в первую очередь — меченные 35S). Особенно осторожно следует подходить к интерпретации радиоавтографических сигналов, расположенных на краю среза. Необходимо учитывать возможность образования неполностью комплементарных дуплексов с негомологичными нуклеиновыми кислотами, электростатическое взаимодействие зонда с заряженными группами, застревание зонда в трехмерной структуре среза. Для адекватной интерпретации данных необходим хороший микроскоп, позволяющий проводить темнопольную и фазовоконтрастную микроскопию. Каждый эксперимент по изотопной ГИС должен сопровождаться положительными и отрицательными контролями.

Отсутствие гибридизационного сигнала при радиоавтографии не обязательно говорит о том, что в анализируемом образце вообще нет искомой мРНК и соответствующего белка — просто число копий мРНК может быть очень мало и чувствительности метода недостаточно для ее обнаружения. Кроме того, при ГИС определяется конститутивный уровень гибридизующейся с зондом специфической мРНК, а при иммуноцитохимии — иммунореактивные белки. И хотя уровень экспрессии большинства генов регулируется содержанием соответствующей РНК, надо с осторожностью подходить к результатам экспериментов с «двойным окрашиванием» (например, при оценке секреторной активности), поскольку количество и тип детектируемых продуктов экспрессии генов зависит также от ряда других факторов, действующих на посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях.

В экспериментах по ГИС чаще всего используют изотопы, испускающие бета-частицы. При работе с ними необходимо соблюдать два основных требования. Следует исключить, во-первых, прямой контакт с изотопом — источником бета-частиц (особенно при работе с 32Р), а во-вторых, распыление радиоактивного материала (образование аэрозолей). Кроме того, помещения, предназначенные для работы с изотопами, должны быть соответствующим образом оборудованы; необходимо обеспечить радиационный контроль, обучить персонал.

- Читать далее "Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: