Контроль специфичности гибридизации гарантирует, что наблюдаемый радиоавтографический сигнал появляется в результате специфического взаимодействия нуклеиновых кислот. К числу неспецифических взаимодействий относятся краевые эффекты и прилипание зонда к определенным типам тканей, а к числу слабоспецифических — связывание зонда с рибосомной РНК и с родственными мишени последовательностями. Вклад этих взаимодействий в суммарный гибридизационный сигнал можно оценить, проведя гибридизацию дополнительных срезов ткани с неродственными зондами или со смысловыми зондами.

Специфичность гибридизации можно оценить, зная предполагаемую температуру плавления гибридов между зондом и мишенью. Специфический сигнал не будет изменяться при повышении жесткости условий гибридизации, тогда как при неспецифическом или слабом связывании при повышении температуры гибриды будут диссоциировать.

Убедиться в том, что гибридизационный сигнал связан со специфическим взаимодействием зонда и РНК, позволяет предварительная обработка срезов РНКазой. Полное исчезновение сигнала при такой обработке указывает на то, что зонд связывается только с расщепляемыми РНКазой нуклеиновыми кислотами. Для проведения такого контроля срезы перед предгибридизацией в течение 30 мин обрабатывают РНКазой (20 мкг/мл), а затем проводят гибридизацию, как это описано в протоколе.

Этот контроль является наименее количественным и наиболее важным. При ГИС необходимо быть уверенным в том, что радиоавтографический сигнал соответствует известным анатомическим структурам. При этом сигналы в клетках определенного типа должны отражать распределение этих клеток в ткани, а соседние, гистологически отличающиеся клетки по возможности вообще не должны давать гибридизационный сигнал.

Комбинирование гибридизации in situ с другими методами позволяет расширить возможности контроля специфичности гибридизации. Имея серийные срезы, можно использовать гистохимические методы, например окрашивание иммунопероксидазой.

В этом случае приходится тщательно контролировать множество разных параметров: толщину срезов, сохранность нуклеиновых кислот, постоянство условий гибридизации и проявления, толщину и однородность эмульсии, доступность стандартных тканей, возможность построения стандартных кривых. Однако в любом случае «количественная» ГИС на самом деле может быть только полуколичественным методом.

Интерпретация данных анализа мРНК

Интерпретация данных, полученных при ГИС, представляет собой весьма непростую задачу. В первую очередь нужно убедиться в специфичности наблюдаемого радиоавтографического сигнала. Например, некоторые связанные с воспалительными процессами клетки (эозинофилы, макрофаги) неспецифически связывают зонды (в первую очередь — меченные 35S). Особенно осторожно следует подходить к интерпретации радиоавтографических сигналов, расположенных на краю среза. Необходимо учитывать возможность образования неполностью комплементарных дуплексов с негомологичными нуклеиновыми кислотами, электростатическое взаимодействие зонда с заряженными группами, застревание зонда в трехмерной структуре среза. Для адекватной интерпретации данных необходим хороший микроскоп, позволяющий проводить темнопольную и фазовоконтрастную микроскопию. Каждый эксперимент по изотопной ГИС должен сопровождаться положительными и отрицательными контролями.

Отсутствие гибридизационного сигнала при радиоавтографии не обязательно говорит о том, что в анализируемом образце вообще нет искомой мРНК и соответствующего белка — просто число копий мРНК может быть очень мало и чувствительности метода недостаточно для ее обнаружения. Кроме того, при ГИС определяется конститутивный уровень гибридизующейся с зондом специфической мРНК, а при иммуноцитохимии — иммунореактивные белки. И хотя уровень экспрессии большинства генов регулируется содержанием соответствующей РНК, надо с осторожностью подходить к результатам экспериментов с «двойным окрашиванием» (например, при оценке секреторной активности), поскольку количество и тип детектируемых продуктов экспрессии генов зависит также от ряда других факторов, действующих на посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях.

В экспериментах по ГИС чаще всего используют изотопы, испускающие бета-частицы. При работе с ними необходимо соблюдать два основных требования. Следует исключить, во-первых, прямой контакт с изотопом — источником бета-частиц (особенно при работе с 32Р), а во-вторых, распыление радиоактивного материала (образование аэрозолей). Кроме того, помещения, предназначенные для работы с изотопами, должны быть соответствующим образом оборудованы; необходимо обеспечить радиационный контроль, обучить персонал.

- Читать далее "Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии"