Условия отмывания задают жесткость процедуры гибридизации in situ. Они обеспечивают диффузию реагентов, фиксированных в срезе, и отбор достаточно совершенных гибридов между зондом и мРНК-мишенью. Процедура отмывания, которой мы следуем, описана в протоколе.

Отмывание препаратов после гибридизации

Материалы
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат Na, pH 7,0
• Маточный раствор РНКазы: 10 мг/мл в дистиллированной воде. Хранят при -20 °С
• Раствор РНКазы А: 20 мкг/мл РНКазы А в 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 1мМ ЭДТА
• 70%, 90% и 100% этанол, содержащий 0,3 М ацетат аммония

Методика
1. Снимают покровные стекла, погрузив препараты в 4 х SSC.
2. Промывают стекла в трех сменах 4 х SSC при 40 С в течение 20 мин в каждой смене, аккуратно помешивая раствор.
3. Удаляют негибридизовавшийся одноцепочечный кРНК-зонд инкубированием в растворе РНКазы в течение 30 мин при 37 С.
4. Промывают стекла в 2 х SSC в течение 30 мин при 40°С, затем в 0,1 х SSC в течение 30 мин при 40°С.
5. Проводят дегидратацию в 70%, 90%, затем в двух сменах 100% этанола, содержащего 0,3 М ацетат аммония, в течение 10 мин при комнатной температуре.
6. Высушивают стекла на воздухе при комнатной температуре в течение 1 ч.

Неспецифическое связывание можно существенно уменьшить, если обработать срезы РНКазой, избирательно расщепляющей негибридизовавшиеся участки РНК.

Радиоавтография срезов для выявления мРНК

В опытах по гибридизации in situ используют эмульсию Ilford К5 (Kodak, UK). При комнатной температуре эта эмульсия полутвердая и становится жидкой при нагревании до 42 °С с равным объемом дистиллированной воды.

Саму эмульсию и экспонируемые срезы нужно держать в холодильнике, который никогда не используется для хранения других радиоизотопов: если в том же холодильнике находится даже сильно разбавленный раствор 32Р, это быстро приведет к появлению недопустимо высокого фона.
Рекомендуемая нами процедура радиоавтографии описана в протоколе.

Радиоавтография срезов

1. Сосуд с эмульсией и камеру для погружения срезов помещают на 10-15 мин в водяную баню с температурой 45 С, чтобы расплавить эмульсию. Затем медленно, не допуская образования пузырьков воздуха, эмульсию выливают в камеру для погружения срезов.
2. Срезы погружают в эмульсию и ставят их торцом в штатив.
3. Высушивают срезы на воздухе в течение как минимум 3 ч. Это время можно уменьшить до 1 ч, если использовать для подсушивания неискрящий фен.
4. Высушенные срезы хранят в светонепроницаемой пластиковой коробке с небольшим количеством силикагеля. Заклеивают коробку черной изолентой и экспонируют ее в хорошо защищенном от света контейнере при 4 С.

При повышенной влажности может произойти «выцветание» изображения, и если сигнал очень слабый, «выцветание» и проявление могут компенсировать друг друга. Если же влажность невелика, то при длительной экспозиции можно выявить и очень слабый сигнал. Время экспозиции варьирует от нескольких часов до нескольких суток, и чтобы оптимизировать его, необходимо иметь несколько одинаковых срезов, при проявлении которых через определенное время можно подобрать наиболее удачное время экспозиции. 5. Полученные радиоавтографы лучше проявлять при температуре 18—20 С, хотя этот температурный диапазон не критичен, просто при более низких температурах образуются зерна серебра меньшего размера. Важнее, чтобы срезы, проявитель, закрепитель и другие растворы имели одинаковую температуру, поскольку при резком ее изменении может произойти сморщивание эмульсии. Проявление осуществляют по следующей схеме:

а) проявитель Kodak D19: 2,5 мин;
б) «стоп»-ванна (вода): 30 с;
в) быстрый закрепитель Kodak: 5 мин;
г) промывание в дистиллированной воде: 15 мин (можно проводить при дневном освещении);
д) при проявлении срезов аккуратно перемешивают проявитель, покачивая ванну вперед-назад (6 с — покачивание, 6 с — покой). Благодаря этому концентрация проявителя не уменьшается вблизи участков среза с высокой плотностью зерен серебра. Срезы лучше покачивать и при закреплении и отмывании, однако на этих этапах перемешивание не столь критично, как во время проявления;
е) сразу после последнего промывания окрашивают срезы гематоксилином.

- Читать далее "Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК"