Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами

Для правильной интерпретации результатов НГИС необходимо использовать соответствующие контроли, поскольку специфический гибридизационный сигнал легко перепутать с неспецифическим, обусловленным связыванием зонда с негомологичными ДНК и РНК, а также с другими клеточными и внеклеточными компонентами.

Отрицательные контроли гибридизации мРНК

К числу отрицательных контролей для проверки специфичности зонда относятся:
• исключение зонда из раствора для гибридизации;
• использование неспецифических зондов (в идеале имеющих такие же GC-содержание, размер и уровень мечения), например,
а) смысловых РНК-зондов, если только не анализируются гены, которые транскрибируются в обоих направлениях (типа с-myc);
б) прокариотических последовательностей (например, плазмидных векторов);
в) генов, экспрессирующихся только в специфических клетках (например, глобиновых генов);

• обработка срезов перед гибридизацией РНКазой (которая должна приводить к исчезновению сигнала) и ДНКазой (которая не должна влиять на РНК-специфический сигнал).
Мы используем в качестве отрицательных контролей гибридизацию без зонда, обработку нуклеазами и гибридизацию со смысловыми РНК-зондами.

гибридизация мрнк

Положительные контроли гибридизации мРНК

Положительные контроли позволяют исключить получение ложноотрицательных результатов, которые могут возникать по техническим причинам или вследствие низкой чувствительности метода. В число таких контролей входят:
• линии клеток, в которых исследуемый ген экспрессируется с образованием необходимого числа копий;
• зонды для конститутивно экспрессирующихся генов, таких как гены актина и тубулина;
• образцы тканей, для которых ранее при гибридизации был получен положительный сигнал.
Мы используем в качестве положительного контроля биоптаты, для которых ранее был получен положительный сигнал.

Первые оценки специфичности зонда

Для первых оценок специфичности зонда можно использовать следующие процедуры (при повседневной работе их можно опустить):
• применение нескольких зондов, комплементарных неперекрывающимся участкам последовательности-мишени;
• конкурентное ингибирование при добавлении немеченого зонда;
• ступенчатое увеличение жесткости условий гибридизации или условий отмывания после гибридизации и определение температуры плавления гибридов зонд—мишень;
• сопоставление локализации гибридизационного сигнала с положением белка, известным из анатомических или имму-ноцитохимических данных (впрочем, корреляция между расположением белка и соответствующей мРНК наблюдается не всегда).
2. Получение образцов тканей и подготовка их к гибридизации

Предупреждение загрязнения РНКазами

На коже человека всегда есть рибонуклеазы, инактивировать которые достаточно сложно. Эти ферменты не разрушаются при автоклавировании, поэтому, готовя реактивы и образцы тканей, необходимо предпринимать специальные меры, чтобы в них не попали РНКазы. Все работы следует проводить в перчатках, которые надо регулярно менять. Если это возможно, лучше использовать одноразовую стерильную, свободную от РНКаз пластиковую посуду, Стеклянную посуду для инактивации РНКаз необходимо промыть этонолом и пероксидом водорода (Н2О2). Если вы работаете в перчатках, то стеклянные предметные стекла можно не подвергать какой-то специальной обработке. При всех манипуляциях с РНК необходимо использовать отдельные реактивы, а все растворы должны быть обработаны ДЭПК или приготовлены на ДЭПК-воде. Все эти меры предосторожности особенно важны при осваивании нового метода и с накоплением опыта соответствующие протоколы могут быть упрощены. Мы считаем, что при проведении РНК-ГИС на залитых в парафин архивных тканях (обращение с которыми и фиксация были далеко не идеальными) необходимо использовать только обработанную ДЭПК воду.

Обработка стеклянной посуды для ингибирования РНКаз

1. Ополаскивают посуду 95% этанолом.
2. Промывают в течение 10 мин 3% (о/о) пероскидом водорода.
3. Ополаскивают в обработанной ДЭПК воде.
4. Высушивают в сушильном шкафу, предназначенном только для работы с РНК.
5. Хранят посуду в защищенном от пыли месте, не допуская ее контакта с другими материалами.

Подготовка обработанных ДЭПК воды и растворов реактивов

1. В вытяжном шкафу в дистиллированную воду или растворы добавляют ДЭПК (Sigma, UK) до конечной концентрации 0,1%.
2. Тщательно перемешивают для полного растворения ДЭПК.
3. Оставляют воду или растворы на ночь.
4. Для стерилизации и удаления ДЭПК автоклавируют растворы или воду в течение 10 мин.

- Читать далее "Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: