Для правильной интерпретации результатов НГИС необходимо использовать соответствующие контроли, поскольку специфический гибридизационный сигнал легко перепутать с неспецифическим, обусловленным связыванием зонда с негомологичными ДНК и РНК, а также с другими клеточными и внеклеточными компонентами.

Отрицательные контроли гибридизации мРНК

К числу отрицательных контролей для проверки специфичности зонда относятся:
• исключение зонда из раствора для гибридизации;
• использование неспецифических зондов (в идеале имеющих такие же GC-содержание, размер и уровень мечения), например,
а) смысловых РНК-зондов, если только не анализируются гены, которые транскрибируются в обоих направлениях (типа с-myc);
б) прокариотических последовательностей (например, плазмидных векторов);
в) генов, экспрессирующихся только в специфических клетках (например, глобиновых генов);

• обработка срезов перед гибридизацией РНКазой (которая должна приводить к исчезновению сигнала) и ДНКазой (которая не должна влиять на РНК-специфический сигнал).
Мы используем в качестве отрицательных контролей гибридизацию без зонда, обработку нуклеазами и гибридизацию со смысловыми РНК-зондами.

Положительные контроли гибридизации мРНК

Положительные контроли позволяют исключить получение ложноотрицательных результатов, которые могут возникать по техническим причинам или вследствие низкой чувствительности метода. В число таких контролей входят:
• линии клеток, в которых исследуемый ген экспрессируется с образованием необходимого числа копий;
• зонды для конститутивно экспрессирующихся генов, таких как гены актина и тубулина;
• образцы тканей, для которых ранее при гибридизации был получен положительный сигнал.
Мы используем в качестве положительного контроля биоптаты, для которых ранее был получен положительный сигнал.

Первые оценки специфичности зонда

Для первых оценок специфичности зонда можно использовать следующие процедуры (при повседневной работе их можно опустить):
• применение нескольких зондов, комплементарных неперекрывающимся участкам последовательности-мишени;
• конкурентное ингибирование при добавлении немеченого зонда;
• ступенчатое увеличение жесткости условий гибридизации или условий отмывания после гибридизации и определение температуры плавления гибридов зонд—мишень;
• сопоставление локализации гибридизационного сигнала с положением белка, известным из анатомических или имму-ноцитохимических данных (впрочем, корреляция между расположением белка и соответствующей мРНК наблюдается не всегда).
2. Получение образцов тканей и подготовка их к гибридизации

Предупреждение загрязнения РНКазами

На коже человека всегда есть рибонуклеазы, инактивировать которые достаточно сложно. Эти ферменты не разрушаются при автоклавировании, поэтому, готовя реактивы и образцы тканей, необходимо предпринимать специальные меры, чтобы в них не попали РНКазы. Все работы следует проводить в перчатках, которые надо регулярно менять. Если это возможно, лучше использовать одноразовую стерильную, свободную от РНКаз пластиковую посуду, Стеклянную посуду для инактивации РНКаз необходимо промыть этонолом и пероксидом водорода (Н2О2). Если вы работаете в перчатках, то стеклянные предметные стекла можно не подвергать какой-то специальной обработке. При всех манипуляциях с РНК необходимо использовать отдельные реактивы, а все растворы должны быть обработаны ДЭПК или приготовлены на ДЭПК-воде. Все эти меры предосторожности особенно важны при осваивании нового метода и с накоплением опыта соответствующие протоколы могут быть упрощены. Мы считаем, что при проведении РНК-ГИС на залитых в парафин архивных тканях (обращение с которыми и фиксация были далеко не идеальными) необходимо использовать только обработанную ДЭПК воду.

Обработка стеклянной посуды для ингибирования РНКаз

1. Ополаскивают посуду 95% этанолом.
2. Промывают в течение 10 мин 3% (о/о) пероскидом водорода.
3. Ополаскивают в обработанной ДЭПК воде.
4. Высушивают в сушильном шкафу, предназначенном только для работы с РНК.
5. Хранят посуду в защищенном от пыли месте, не допуская ее контакта с другими материалами.

Подготовка обработанных ДЭПК воды и растворов реактивов

1. В вытяжном шкафу в дистиллированную воду или растворы добавляют ДЭПК (Sigma, UK) до конечной концентрации 0,1%.
2. Тщательно перемешивают для полного растворения ДЭПК.
3. Оставляют воду или растворы на ночь.
4. Для стерилизации и удаления ДЭПК автоклавируют растворы или воду в течение 10 мин.

- Читать далее "Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК"