Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК

Чтобы более полно исследовать экспрессию того или иного гена, можно одновременно локализовать как нуклеиновую кислоту, так и соответствующий ей белок.
Для этого анализуруют серийные срезы поочередно методом гибридизации in situ и иммуноцитохимическим методом или, что более эффективно, одновременно проводят обе процедуры на одном срезе или клеточном препарате.

Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК

1. Прогревают срезы или клеточные препараты, как это описано в протоколе.
2. Проводят гибридизацию с изотопно меченной антисмысловой РНК (1,5 • 106 имп./мин), разведенной в буфере без декстран-сульфата, в течение 16 ч при 45 °С.
3. Промывают срезы в 4 х SSC в течение 1 ч при 37 °С и инкубируют их в растворе РНКазы А 30 мин при 37 °С.

4. Промывают срезы 15 мин b2xSSC и 15 мин в 0,1 х SSC.
5. Проводят иммунологическое окрашивание срезов (мы рекомендуем ПАП- и ABC-методы).
6. Для проведения радиоавтографии срезы покрывают эмульсией К5 и экспонируют 5-7 сут в случае изотопа P и как минимум 15 сут в случае изотопа 35S. Затем срезы проявляют, окрашивают гематоксилином и накрывают покровными стеклами.

гибридизация мРНК

Контроли и специфичность гибридизации in situ мРНК

Как и другие гистохимические методы анализа, гибридизация in situ должна сопровождаться проведением соответствующих контрольных экспериментов, в первую очередь на анализируемую ткань, зонд и все реактивы).

Тканевой препарат должен быть приготовлен таким образом. .чтобы обеспечивалась максимальная сохранность нуклеиновых кислот в срезе. Для контроля проводят гибридизацию с зондами, заведомо хорошо гибридизующимися с исследуемой тканью, используя дополнительные срезы.

Кроме того, ткань нужно проверить на наличие специфической мРНК с помощью Нозерн-блот-гибридизации. Этот контроль особенно важен, когда нужно убедиться в полном отсутствии специфической гибридизации или изменении содержания мРНК при тех или иных физиологических условиях. Но следует иметь в виду, что при Нозерн-блот-гибридизации определяется содержание мРНК в больших, часто гетерогенных клеточных популяциях, а методом ГИС мРНК иногда выявляется в таком небольшом числе клеток, что для ее детекции чувствительности Нозерн-блот-тинга оказывается недостаточно.

Для оценки специфичности зонда лучше всего использовать Нозерн-блот-гибридизацию, при которой зонд должен гибридизоваться со специфической мРНК, содержащей комплементарную нуклеотидную последовательность. Кроме того, при Нозернблоттинге можно точно определить температуру плавления гибрида мРНК/зонд. Зная эту температуру, можно выбрать степень жесткости условий гибридизации, необходимую при последующих экспериментах со срезами.

- Читать далее "Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК"

Оглавление темы "Диагностика мРНК. Исследование мРНК":
1. Размер зонда для мРНК. Работа с тканями для диагностики мРНК
2. Предварительная обработка клеток и тканей. Гибридизация мРНК с кРНК-зондами
3. Отмывание препаратов после гибридизации мРНК. Радиоавтография срезов для выявления мРНК
4. Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК. Контроли и специфичность гибридизации мРНК
5. Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК
6. Исследование мРНК в биоптатах. Исследование мРНК при цитологии и аутопсии<
7. Неизотопная гибридизация мРНК. Клеточные линии как модельные системы мРНК
8. Контроли гибридизации мРНК. Предупреждение загрязнения РНКазами
9. Образцы неизотопной гибридизация мРНК. Фиксация для неизотопной гибридизация мРНК
10. Демаскирование нуклеиновых кислот при неизотопной гибридизации мРНК. Зонды неизотопной гибридизация мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: