Чтобы более полно исследовать экспрессию того или иного гена, можно одновременно локализовать как нуклеиновую кислоту, так и соответствующий ей белок.
Для этого анализуруют серийные срезы поочередно методом гибридизации in situ и иммуноцитохимическим методом или, что более эффективно, одновременно проводят обе процедуры на одном срезе или клеточном препарате.

Одновременное проведение гибридизации in situ и иммуноцитохимического анализа мРНК

1. Прогревают срезы или клеточные препараты, как это описано в протоколе.
2. Проводят гибридизацию с изотопно меченной антисмысловой РНК (1,5 • 10⁶ имп./мин), разведенной в буфере без декстран-сульфата, в течение 16 ч при 45 °С.
3. Промывают срезы в 4 х SSC в течение 1 ч при 37 °С и инкубируют их в растворе РНКазы А 30 мин при 37 °С.

4. Промывают срезы 15 мин b2xSSC и 15 мин в 0,1 х SSC.
5. Проводят иммунологическое окрашивание срезов (мы рекомендуем ПАП- и ABC-методы).
6. Для проведения радиоавтографии срезы покрывают эмульсией К5 и экспонируют 5-7 сут в случае изотопа P и как минимум 15 сут в случае изотопа 35S. Затем срезы проявляют, окрашивают гематоксилином и накрывают покровными стеклами.

Контроли и специфичность гибридизации in situ мРНК

Как и другие гистохимические методы анализа, гибридизация in situ должна сопровождаться проведением соответствующих контрольных экспериментов, в первую очередь на анализируемую ткань, зонд и все реактивы).

Тканевой препарат должен быть приготовлен таким образом. .чтобы обеспечивалась максимальная сохранность нуклеиновых кислот в срезе. Для контроля проводят гибридизацию с зондами, заведомо хорошо гибридизующимися с исследуемой тканью, используя дополнительные срезы.

Кроме того, ткань нужно проверить на наличие специфической мРНК с помощью Нозерн-блот-гибридизации. Этот контроль особенно важен, когда нужно убедиться в полном отсутствии специфической гибридизации или изменении содержания мРНК при тех или иных физиологических условиях. Но следует иметь в виду, что при Нозерн-блот-гибридизации определяется содержание мРНК в больших, часто гетерогенных клеточных популяциях, а методом ГИС мРНК иногда выявляется в таком небольшом числе клеток, что для ее детекции чувствительности Нозерн-блот-тинга оказывается недостаточно.

Для оценки специфичности зонда лучше всего использовать Нозерн-блот-гибридизацию, при которой зонд должен гибридизоваться со специфической мРНК, содержащей комплементарную нуклеотидную последовательность. Кроме того, при Нозернблоттинге можно точно определить температуру плавления гибрида мРНК/зонд. Зная эту температуру, можно выбрать степень жесткости условий гибридизации, необходимую при последующих экспериментах со срезами.

- Читать далее "Специфичность гибридизации мРНК. Интерпретация данных анализа мРНК"