Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли

Для определения числа сигналов просматривают примерно 200 ядер. Предполагается, что число сигналов, полученных при гибридизации со специфичными к центромерной ДНК зондами, равно числу хромосомных копий (плоидности). Доля клеток, не дающих гибридизационного сигнала, в разных экспериментах неодинакова; как правило, такая артефактная «нуль-сомия» составляет 10%. Однако при оптимальной предварительной обработке препаратов (оптимальном протеолизе и отсутствии фона, маскирующего ядра) эта величина может составлять всего 3%. Если при выявлении анеуплоидных и тетраплоидных клеток в опухолевых тканях (в первую очередь методом проточной цитометрии) получен высокий процент (>15%) ядер, не дающих гибридизационного сигнала, это неизбежно приводит к занижению числа хромосомных копий или гетерогенности опухоли. Доля ядер с одним гибридизационным сигналом для диплоидных клеток варьирует от 5 до 20% в зависимости от процедуры гибридизации.

Всегда есть ядра, в которых флуоресцентные пятна располагаются так близко друг к другу, что выглядят как одно, Если число клеток с одним сигналом на ядро в клеточной популяции превышает 20%, то есть веские основания считать их моносомными по определенной хромосоме; впрочем, при гибридизации с двумя мишенями этот произвольно взятый минимальный процент может уменьшиться до 10%. Если доля полиплоидных клеток превышает 5% от общего числа клеток (произвольно), то можно думать о трисомии или тетрасомии опухоли. В этом случае из подсчета должны быть исключены перекрывающиеся ядра, а также слабые и двойные гибридизационные сигналы. Перечислим типичные проблемы, которые возникают при интерпретации результатов гибридизации in situ в случае анеуплоидных клеток.

а. Спаривание хромосом может приводить к тому, что вместо двух сигналов будет наблюдаться один, как при моносомии. Заметим, что соматическая конъюгация хромосом 1 и 17 обнаружена, например, в нормальных тканях головного мозга.
б. Нередко происходят транслокации части короткого плеча хромосомы 15 на другие хромосомы D-группы. В таком случае при гибридизации in situ зонда, специфичного для хромосомы 15, в интерфазных ядрах проявляются три сигнала, и делается вывод о трисомии по хромосоме 15.
в. Хромосомный полиморфизм, например по хромосомам 1 и 9, приводит к вариабельности интенсивности гибридизационного сигнала при гибридизации с хромосомоспецифичными последовательностями сателлитной ДНК. Учет слабых сигналов, отвечающих, например, минорным сайтам связывания, может привести к неверной оценке числа хромосомных копий.

Для более точной интерпретации результатов следует руководствоваться следующими правилами.
а. Не учитывать перекрывающиеся ядра.
б. Если нет никаких указаний на делении или хромосомный полиморфизм, то следует учитывать только ядра с более или менее одинаковыми по интенсивности флуоресценции гибридизационными сигналами.
в. Не принимать во внимание слабые гибридизационные сигналы.
г. Учитывать только четкие, дискретные флуоресцирующие пятна или полосы в ядрах.

изолированные клетки опухоли

Парафиновые срезы опухоли

При интерпретации результатов гибридизации на парафиновых и замороженных срезах в принципе используются те же критерии, что и для суспензий изолированных клеток. Однако в случае парафиновых срезов доля нормальных клеток, вообще не дающих сигнала или дающих один сигнал, выше (примерно 25%), чем в случае суспензий (примерно 5%), что требует более тщательного анализа результатов (выбор подходящей части опухоли, нормальной ткани или клеток стромы), поскольку никаких простых критериев «отбраковки» ядер нет. Размер ядер клеток «диплоидных» опухолей, определяемый методом проточной цитометрии, лежит в диапазоне 4—6 мкм.

В этом случае зависимость числа поддающихся детекции ядер от реальной копийности хромосом, обусловленная «отбраковкой», невелика. Истинное число хромосомных копий можно установить почти в 50% ядер, так что случаи моносомии и трисомии не вызывают сомнений. Размер ядер в анеуплоидных и тетраплоидных опухолях колеблется от 6 до 13 мкм (в зависимости от содержания ДНК), и число хромосомных копий может быть занижено. С ростом размера ядер степень этой недооценки будет увеличиваться. Истинное число хромосомных копий можно все же оценить, если считать, что оно равно максимальному числу гибридизационных сигналов на ядро.

Проводя гибридизацию на серийных срезах (при этом в одном эксперименте должны использоваться срезы одинаковой толщины, прошедшие одинаковую протеолитическую обработку) с разными по специфичности зондами, можно оценить несоответствие между числом разных хромосом. В таблице рассмотрены причины некорректности интерпретации результатов гибридизации на парафиновых срезах и возможные пути их устранения. Во всех случаях решение состоит в поисках компромисса между сохранением морфологии препарата и повышением интенсивности гибридизационного сигнала. Прекрасные результаты дает разная по продолжительности ферментативная обработка парафиновых срезов.

Длительный протеолиз обычно приводит к увеличению числа гибридизационных сигналов на фоне «размывания» ядер. Альтернативный подход к оценке числа хромосомных копий методом ГИС на парафиновых и криостатных срезах основан на выделении ядер из толстых срезов. Число «отбракованных» ядер в этом случае оказывается меньше, чем при прямой гибридизации на срезах.

Описанные выше методы гибридизации in sutu применялись для идентификации разных видов злокачественных новообразований: лейкоза, рака молочной железы и женских половых органов, опухолей мозга, рака предстательной железы, яичек, желудка, мочевого пузыря. Однако использование данных интерфазной цитогенетики для выявления хромосомных аберраций затруднительно, поскольку получаемые в этом случае гибридизационные сигналы не позволяют обнаружить сложные структурные перестройки. С помощью используемых в интерфазной цитогенетике зондов можно исследовать только околоцентромерные области хромосом. Для идентификации таких структурных перестроек, как транслокация и делеция длинных и коротких плеч или их частей, необходимо дифференциальное окрашивание целых хромосом.

- Читать далее "Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли"

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: