Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли

Никакой детальной методики выявления количественных или структурных хромосомных аберраций в солидных опухолях не опубликовано. Вообще говоря, замороженные срезы можно фиксировать в метаноле/ацетоне или в более сильном фиксаторе — формальдегиде. Протеолиз не должен быть слишком сильным, чтобы не произошла полная утрата морфологии. В протоколе дана примерная методика гибридизации in situ на замороженных срезах, исходя из которой можно подобрать оптимальные условия процедуры.
Гибридизация in situ на замороженных срезах
Материалы
• Предметные стекла, покрытые поли-L-лизином или органосиланом
• Пепсин из слизистой желудка поросенка (2500—3500 ЕД на 1 мг белка)
• 0,01 М НС1
• Метанол : ацетон (1:1) при -20 °С
• 1 % формальдегид в ФСБ

Методика
1. Монтируют замороженные срезы толщиной 4—6 мкм на предметных стеклах, покрытых поли-L-лизином или органосиланом,
2. Оставляют на ночь при комнатной температуре.
3. Фиксируют срезы в смеси метанол : ацетон (1:1) при -20 С в течение 20 мин.

замороженные срезы опухоли

4. Промывают препараты в двух сменах ФСБ, 0,5% твин-20, по 5 мин в каждой.
5. Инкубируют препараты с пепсином (50-400 мкг на 1 мл 0,01 М НСl) в течение 10 мин при 37 °С. Оптимальные условия протеолиза подбирают опытным путем.
6. Промывают стекла в пяти сменах воды и в пяти сменах ФСБ, налитых в глубокие стаканы.
7. Фиксируют срезы 1 % формалином в ФСБ в течение 10 мин при комнатной температуре.

8. Промывают препараты в пяти сменах ФСБ, затем в пяти сменах воды, налитых в глубокие стаканы.
9. Дегидратируют срезы в трех сменах этанола, 70%, 90% и 100%, по 3 мин в каждой, затем высушивают на воздухе.
10. Наносят на срезы по 5—10 мкл гибридизационной смеси, содержащей 1-3 нг ДНК-зонда, накрывают покровными стеклами и промазывают стекла по краям резиновым клеем.
11. Проводят денатурацию при 70-80 °С в течение 2-4 мин.
12. Оставляют для гибридизации во влажной камере при 37 С на ночь.

- Для лучшего прилипания срезов стекла можно активировать глутаральдегидом.
- Если во время гибридизации морфология препарата очень сильно искажается, можно провести фиксацию 1% формалином в ФСБ в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Чтобы немного повысить проницаемость срезов, препараты можно погрузить на 15 мин в смесь 0,1 М НСl, 0,05% тритон Х-100 (или твин-20).

- Для лучшего сцепления срезов со стеклом предметные стекла можно предварительно прогреть при 80 С в течение 30—60 мин.
- Обычно денатурацию проводят прогреванием препарата при 70 С в течение 3 мин. Зонд и мишень можно денатурировать по отдельности. Мишень денатурируют, погрузив препараты на 3 мин в смесь 70% формамида и 2 х SSC, а затем проведя их через батарею спиртов при 4 °С.
- Для выявления высокоповторяющихся последовательностей в околоцентромерных областях хромосом достаточно двухчасовой гибридизации.

- Читать далее "Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли"

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: