Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Для получения РНК-транскриптов нужного размера, не содержащих или почти не содержащих неспецифических векторных последовательностей, вектор переводят в линейную форму. Для этого расщепляют его в сайте, расположенном либо внутри вставки, либо с 3'-стороны от нее. Обычно для линеаризации используют рестриктазы, сайты узнавания которых входят в полилинкер.

Для получения изотопно меченного одноцепочечного РНК-зонда необходимо транскрибировать кДНК с помощью соответствующей РНК-полимеразы в присутствии изотопно меченных нуклеотидов. Методика транскрипции in vitro описана в протоколе.

Получение меченых РНК-зондов с помощью транскрипции in vitro
Материалы
• 5 х транскрипционный буфер: 200 мМ трис-HCI, рН 7,5, 30 мМ MgCb, 10 мМ спермидин, 5 мМ NaCl
• 100 мМ дитиотрейтол (ДТТ)
• РНКазин: игбитор РНКаз из плаценты человека, 25 ЕД/мкл
• Смесь нуклеотидов: по 2,5 мМ ATP, GTP и UTP
• 100 мкМ СТР («холодный» СТР)

• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА
• Линеаризованная плазмиднаяДНК(1 мкг/мкл) в обычной или дистиллированной воде
• Р- или S-CTP, 10 мКи/мл. Можно также использовать Р-или S-UTP, но при этом необходимо изменить состав смеси нуклеотидов
• РНК-полимеразы фагов SP6, ТЗ или Т7 в зависимости от используемого вектора. Все эти ферменты очень лабильны; их можно держать вне холодильника минимальное время

транскрипция зондов мРНК

• Свободная от РНКаз ДНКаза (например, фирмы Boehringer Mannheim)
• тРНК: 10 мкг/мкл
• 4 M NaCl
• Фенол : хлороформ (1:1, о/о)

Методика
1. В стерильную микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре вносят в указанном порядке следующие реактивы.
• 5 х транскрипционный буфер 4 мкл
• ДТТ 2 мкл
• РНКазин 0,8 мкл
• Смесь нуклеотидов 4 мкл

• «Холодный» СТР 2,4 мкл
• Плазмидная ДНК 1 мкл
• Радиоактивно меченный СТР 5 мкл
• РНК-полимераза 1 мкл (10 ЕД)
• Обработанная ДЭПК вода 20 мкл до конечного объема

2. Инкубируют реакционную смесь в течение I ч при 37 °С, затем для ускорения транскрипции вносят еще 0,5 мкл (5 ЕД) РНК-полимеразы и продолжают инкубацию 30 мин.
3. Для остановки транскрипции добавляют 1 мкл ДНКазы, свободной от РНКаз, которая расщепляет ДНК-матрицу, и инкубируют 10 мин при 37 С.

4. Для разделения зонда и невключившихся нуклеотидов к реакционной смеси добавляют:
• тРНК 1 мкл
• обработанную ДЭПК воду 175 мкл
• 4 М NaCl 5 мкл
• равный объем (примерно 200 мкл) смеси фенол: хлороформ (1:1)

5. Реакционную смесь перемешивают, центрифугируют 5 мин при 12 000 g в микроцентрифуте и удаляют водную фазу (примерно 200 мкл). Повторяют экстракцию равным объемом хлороформа.
6. Добавляют к супернатанту 100 мкл 7 М ацетата аммония (до конечной концентрации 2,5 М) и 750 мкл (примерно 2,5 объема) холодного (из морозильника на -20 °С) абсолютного этанола, перемешивают и для образования осадка оставляют на ночь при —20 °С или на 2 ч при —80 С.

7. Собирают РНК центрифугированием при 12 000 g в течение 20 мин и удаляют супернатант. Осадок РНК подсушивают под вакуумом, затем растворяют его в 20 мкл обработанной ДЭПК воды. Отбирают 1 мкл раствора для определения радиоактивности.
8. Р-зонды хранят при —20 °С, а S-зонды — при -80 С.
9. Определяют радиоактивность аликвоты раствора зонда с помощью счетчика (если необходимо — с использованием сцинтилляторов).

Выбор изотопа для мечения зонда определяется компромиссом между теми чувствительностью и разрешением, которые хотят получить. Для повышения чувствительности лучше использовать изотопы Р или S. Однако их недостатком является то, что испускаемые ими высокоэнергетические частицы до своего поглощения проходят в фотоэмульсии весьма большое расстояние, образуя на своем пути зерна серебра, так что разрешение радиоавтографов снижается. Такие изотопы, как Н, испускающие низкоэнергетическое излучение, позволяют получать хорошее разрешение, но требуют длительной экспозиции.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: