Для получения РНК-транскриптов нужного размера, не содержащих или почти не содержащих неспецифических векторных последовательностей, вектор переводят в линейную форму. Для этого расщепляют его в сайте, расположенном либо внутри вставки, либо с 3'-стороны от нее. Обычно для линеаризации используют рестриктазы, сайты узнавания которых входят в полилинкер.

Для получения изотопно меченного одноцепочечного РНК-зонда необходимо транскрибировать кДНК с помощью соответствующей РНК-полимеразы в присутствии изотопно меченных нуклеотидов. Методика транскрипции in vitro описана в протоколе.

Получение меченых РНК-зондов с помощью транскрипции in vitro
Материалы
• 5 х транскрипционный буфер: 200 мМ трис-HCI, рН 7,5, 30 мМ MgCb, 10 мМ спермидин, 5 мМ NaCl
• 100 мМ дитиотрейтол (ДТТ)
• РНКазин: игбитор РНКаз из плаценты человека, 25 ЕД/мкл
• Смесь нуклеотидов: по 2,5 мМ ATP, GTP и UTP
• 100 мкМ СТР («холодный» СТР)

• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА
• Линеаризованная плазмиднаяДНК(1 мкг/мкл) в обычной или дистиллированной воде
• Р- или S-CTP, 10 мКи/мл. Можно также использовать Р-или S-UTP, но при этом необходимо изменить состав смеси нуклеотидов
• РНК-полимеразы фагов SP6, ТЗ или Т7 в зависимости от используемого вектора. Все эти ферменты очень лабильны; их можно держать вне холодильника минимальное время

• Свободная от РНКаз ДНКаза (например, фирмы Boehringer Mannheim)
• тРНК: 10 мкг/мкл
• 4 M NaCl
• Фенол : хлороформ (1:1, о/о)

Методика
1. В стерильную микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре вносят в указанном порядке следующие реактивы.
• 5 х транскрипционный буфер 4 мкл
• ДТТ 2 мкл
• РНКазин 0,8 мкл
• Смесь нуклеотидов 4 мкл

• «Холодный» СТР 2,4 мкл
• Плазмидная ДНК 1 мкл
• Радиоактивно меченный СТР 5 мкл
• РНК-полимераза 1 мкл (10 ЕД)
• Обработанная ДЭПК вода 20 мкл до конечного объема

2. Инкубируют реакционную смесь в течение I ч при 37 °С, затем для ускорения транскрипции вносят еще 0,5 мкл (5 ЕД) РНК-полимеразы и продолжают инкубацию 30 мин.
3. Для остановки транскрипции добавляют 1 мкл ДНКазы, свободной от РНКаз, которая расщепляет ДНК-матрицу, и инкубируют 10 мин при 37 С.

4. Для разделения зонда и невключившихся нуклеотидов к реакционной смеси добавляют:
• тРНК 1 мкл
• обработанную ДЭПК воду 175 мкл
• 4 М NaCl 5 мкл
• равный объем (примерно 200 мкл) смеси фенол: хлороформ (1:1)

5. Реакционную смесь перемешивают, центрифугируют 5 мин при 12 000 g в микроцентрифуте и удаляют водную фазу (примерно 200 мкл). Повторяют экстракцию равным объемом хлороформа.
6. Добавляют к супернатанту 100 мкл 7 М ацетата аммония (до конечной концентрации 2,5 М) и 750 мкл (примерно 2,5 объема) холодного (из морозильника на -20 °С) абсолютного этанола, перемешивают и для образования осадка оставляют на ночь при —20 °С или на 2 ч при —80 С.

7. Собирают РНК центрифугированием при 12 000 g в течение 20 мин и удаляют супернатант. Осадок РНК подсушивают под вакуумом, затем растворяют его в 20 мкл обработанной ДЭПК воды. Отбирают 1 мкл раствора для определения радиоактивности.
8. Р-зонды хранят при —20 °С, а S-зонды — при -80 С.
9. Определяют радиоактивность аликвоты раствора зонда с помощью счетчика (если необходимо — с использованием сцинтилляторов).

Выбор изотопа для мечения зонда определяется компромиссом между теми чувствительностью и разрешением, которые хотят получить. Для повышения чувствительности лучше использовать изотопы Р или S. Однако их недостатком является то, что испускаемые ими высокоэнергетические частицы до своего поглощения проходят в фотоэмульсии весьма большое расстояние, образуя на своем пути зерна серебра, так что разрешение радиоавтографов снижается. Такие изотопы, как Н, испускающие низкоэнергетическое излучение, позволяют получать хорошее разрешение, но требуют длительной экспозиции.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."