Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации

Зонды, использующиеся для локализации специфических нуклеотидных последовательностей в клетках с ненарушенной морфологией, на распластанных хромосомах или на тканевых срезах, можно пометить с помощью радиоактивных изотопов или неизотопными методами. Преимущество метода неизотопной гибридизации in situ (НГИС) состоит в том, что он обеспечивает достаточно высокое разрешение, практически безопасен, не требует много времени и относительно прост. Методы неизотопного мечения основаны на присоединении к зонду молекулы-свидетеля и проведении иммуноцитохимического анализа после гибридизации зонда со специфической мишенью. Используют два подхода.

а. Ферментативное включение в ДНК-зонд биотина, дигоксигенина, БУДР или флуоресцеина с помощью ник-трансляции или метода рассеянной затравки.
б. Химическую модификацию зонда, заключающуюся во введении биотинового остатка, ацетиламинофлуореновой группы (ААФ) или ионов ртути. К последним после гибридизации присоединяют молекулы тиолгаптена и сульфонируют их.

Модифицированные зонды обычно выявляют иммуноцитохи-мическими методами, а биотинилированные — с помощью меченого авидина (стрептавидина) или моноклональных антител к биотину. Применяют следующие системы.

а. Непрямые иммуноцитохимические методы с использованием антител к биотину или дигоксигенину и вторых антител, конъюгированных с флуорохромами, например с флуо-ресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), родамином или амино-метилкумаринуксусной кислотой (АМКУ).

б. Непрямые иммуноцитохимические методы с использованием таких ферментов, как пероксидаза (с подходящими системами усиления) или щелочная фосфатаза, конъюги-рованные с антителами.

выявление опухолевых клеток

в. Прямые цитохимические методы с использованием конъюгированного авидина или конъюгированных первых антител.
г. Авидин/биотинилированные антитела к авидину.
В протоколе описаны методы иммуноцитохимической детекции, наиболее удобные при ГИС на клеточных суспензиях и парафиновых срезах.

Отмывание препаратов после гибридизации

Материалы:
• Формамид
• Твин-20
• 20 х SSC

Методика:
1. Вынимают стекла из термостата и пинцетом снимают пленку резинового клея, скрепляющую вместе предметное и покровное стекла.
2. Промывают препараты при 42 °С в трех сменах буфера следующего состава: 60% формамид, 2 х SSC, рН 7,0, 0,05% твин-20, по 5 мин в каждой смене. Покровное стекло легко снимается уже в первой смене".
3. Промывают препараты при 42 С в двух сменах 2 х SSC, по 5 мин в каждой.

- Читать далее "Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах"

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: