Зонды, использующиеся для локализации специфических нуклеотидных последовательностей в клетках с ненарушенной морфологией, на распластанных хромосомах или на тканевых срезах, можно пометить с помощью радиоактивных изотопов или неизотопными методами. Преимущество метода неизотопной гибридизации in situ (НГИС) состоит в том, что он обеспечивает достаточно высокое разрешение, практически безопасен, не требует много времени и относительно прост. Методы неизотопного мечения основаны на присоединении к зонду молекулы-свидетеля и проведении иммуноцитохимического анализа после гибридизации зонда со специфической мишенью. Используют два подхода.

а. Ферментативное включение в ДНК-зонд биотина, дигоксигенина, БУДР или флуоресцеина с помощью ник-трансляции или метода рассеянной затравки.
б. Химическую модификацию зонда, заключающуюся во введении биотинового остатка, ацетиламинофлуореновой группы (ААФ) или ионов ртути. К последним после гибридизации присоединяют молекулы тиолгаптена и сульфонируют их.

Модифицированные зонды обычно выявляют иммуноцитохи-мическими методами, а биотинилированные — с помощью меченого авидина (стрептавидина) или моноклональных антител к биотину. Применяют следующие системы.

а. Непрямые иммуноцитохимические методы с использованием антител к биотину или дигоксигенину и вторых антител, конъюгированных с флуорохромами, например с флуо-ресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), родамином или амино-метилкумаринуксусной кислотой (АМКУ).

б. Непрямые иммуноцитохимические методы с использованием таких ферментов, как пероксидаза (с подходящими системами усиления) или щелочная фосфатаза, конъюги-рованные с антителами.

в. Прямые цитохимические методы с использованием конъюгированного авидина или конъюгированных первых антител.
г. Авидин/биотинилированные антитела к авидину.
В протоколе описаны методы иммуноцитохимической детекции, наиболее удобные при ГИС на клеточных суспензиях и парафиновых срезах.

Отмывание препаратов после гибридизации

Материалы:
• Формамид
• Твин-20
• 20 х SSC

Методика:
1. Вынимают стекла из термостата и пинцетом снимают пленку резинового клея, скрепляющую вместе предметное и покровное стекла.
2. Промывают препараты при 42 °С в трех сменах буфера следующего состава: 60% формамид, 2 х SSC, рН 7,0, 0,05% твин-20, по 5 мин в каждой смене. Покровное стекло легко снимается уже в первой смене".
3. Промывают препараты при 42 С в двух сменах 2 х SSC, по 5 мин в каждой.

- Читать далее "Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах"