Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах

Материалы
• Буфер А: 4 х SSC, 0,05% твин-20, рН 7,0
• 10 х ФСБ: 1,5 М NaCl, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2
• Обезжиренное сухое молоко
• ФИТЦ-конъюгированный авидин (Vector Laboratories)
• Биотинилированные козьи антитела к авидину (Vector Laboratories)
• Реагент, предотвращающий выцветание, и контрастирующее вещество.

Методика
1. Промывают препараты в буфере А в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Инкубируют препараты и 5% (в/о) обезжиренном сухом молоке, растворенном в буфере А, в течение 15 мин при 37 С.
3. Инкубируют препараты с комплексом ФИТЦ—авидин, растворенным в буфере А (5 мкг/мл), в течение 20 мин при 37 С,

детекция опухоли

4. Промывают препараты в трех сменах буфера А, по 5 мин в каждой.
5. Усиливают сигнал 20-минутной инкубацией препаратов при . 37 °С с биотинилированными козьими антителами к авидину, разведенными буфером А в отношении 1:100. Промывают препараты в трех сменах буфера А, по 5 мин в каждой, и вновь инкубируют их в течение 20 мин при 37 С с комплексом ФИТЦ—авидин (5 мкг/мл в буфере А).
6. Промывают препараты в двух сменах буфера А, по 5 мин в каждой, а затем 5 мин — в ФСБ.

7. Проводят препараты через серию спиртов, 70%, 90%, 100% этанол, по 3 мин в каждом, и высушивают их на воздухе.
8. Заключают препараты в трис-НCl-глицерин, содержащий реагент, предотвращающий выцветание, и контрастирующее вещество.

Иммуноцитохимическая детекция: парафиновые срезы (пероксидазная метка)

Материалы
• Буфер В: 1 х ФСБ, 0,05% твин-20
• Нормальная кроличья сыворотка (НКС)
• 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорид и пероксид водорода
• 0,1 М имидазол

• Гематоксилин (Merck)
• Среда для заключения препаратов (BDH, Poole, UK)
• Мышиные антитела к биотину (Dakopatts)
• Конъюгированные с пероксидазой кроличьи антитела к иммуноглобулину мыши (Dakopatts)

Методика
1. Промывают срезы в буфере В при комнатной температуре в течение 5 мин.
2. Инкубируют препараты в течение 15 мин при комнатной температуре с 2% НКС, растворенной в буфере В.
3. Инкубируют препараты в течение 45 мин при 37 С с мышиными антителами к биотину, разведенными в буфере В в отношении 1:100.

4. Промывают препараты втрех сменах буфера В, по 5 мин в каждой.
5. Инкубируют препараты в течение 45 мин при 37 С с меченными пероксидазой кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши, разведенными в буфере В в отношении 1:80. Промывают препараты в трех сменах буфера В, по 5 мин в каждой3'.
6. Инкубируют препараты в 0,05% ДАБ, 0,1 М имидазоле, 0,05% Н2О2, рН 7,6, в течение 5-10 мин в темноте.
7. Промывают препараты в трех сменах ФСБ, по 5 мин в каждой, контрастируют гематоксилином и заключают в среду.

В менее жестких условиях, например при 37 С в 50% формамиде, 2 х SSC, избежать гибридизации с побочными сайтами связывания не удается.
Девять частей глицерина, содержащего 2,3% (в/о) 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октана (ДАБЦО), растворяют при 70 °С в одной части 0,2 М трис-HCl, 0,02% NaN, pH 8,0. Добавляют 4",6-диамино-2-фенилиндол (дающий синюю флуоресценцию ДНК, контрастирующую с красной флуоресценцией ФИТЦ или родамина) или пропидиумиодид (дающий красную флуоресценцию ДНК, контрастирующую с флуоресценцией ФИТЦ), в концентрации примерно 0,5 мкг/мл.

При гибридизации с двумя мишенями, когда в качестве зондов используется ДНК, меченная биотином и дигоксигенином, реагенты для цитохимической детекции наслаивают в следующем порядке: а) моно- или поликлональные антитела к дигоксигенину (Boehringer Mannheim); б) конъюгированные вторые антитела к антидигоксигенину; в) конъюгированный авидин. Инкубации 2 и 3 можно проводить одновременно (в 4х SSC).

Используя зонды, меченные разными гаптенами, которые визуализируют с помощью разных аффинных систем, можно одновременно детектировать несколько мишеней в одной и той же клетке, распластанной хромосоме или на тканевом срезе. Прекрасные результаты дает использование таких сочетений, как флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) с родамином или с техасским красным. С помощью ФИТЦ, родамина и АМК удается выявлять одновременно три и даже четыре разных ДНК-зонда. Гибридизацию in situ с несколькими мишенями можно использовать также для обнаружения количественных и структурных хромосомных аномалий и для установления корреляций между ними.

- Читать далее "Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли"

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: