Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли

При подготовке препаратов для гибридизации in situ можно использовать некоторые стандартные фиксаторы тканей, такие, например, как метанол : уксусная кислота (3:1) (кариотипиро-вание), 70% этанол (проточная цитометрия), метанол : ацетон (цитологические исследования), 4% формальдегид в ФСБ (гистологические исследования). Чтобы повысить проницаемость клеток для макромолекул (ДНК-зондов или антигенов), клетки обрабатывают протеолитическими ферментами. При этом также уменьшается фон, обусловленный аутофлуоресценцией, и увеличивается отношение сигнал/шум при детекции флуоресцентной метки. Следует помнить, однако, что в результате протеолиза изолированные клетки или части тканевых срезов могут утрачиваться, особенно если предметные стекла не обработаны адгезивами. Чтобы избежать этого, стекла покрывают поли-L-лизином, желатиной или силиконом. Иногда обрабатывают препараты 2,5% глутаральдегидом в ФСБ в течение 60 мин при комнатной температуре, затем споласкивают их в ФСБ и дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Такую обработку следует проводить не более чем за несколько дней до гибридизации. Особенно эффективна она в случае парафиновых срезов.

Разбавленные суспензии изолированных клеток легко получить механической или ферментативной дезинтеграцией свежих препаратов солидных опухолей, при этом разработаны специальные методики получения препаратов для последующего выявления хромосомных аномалий с помощью интерфазной цитогенетики. Прежде чем наносить клетки на предметные стекла, из них удаляют плазматические и ядерные белки с помощью спирта / уксусной кислоты, а после нанесения для повышения проницаемости проводят мягкий протеолиз. Такая процедура фиксации аналогична используемой в проточной цитометрии. Клеточные суспензии, фиксированные этанолом, можно хранить годами без какого-либо ухудшения результатов гибридизации, проводимой в соответствии с протоколом. Для повышения специфичности гибридизации и усиления гибридизационного сигнала концентрацию пепсина и продолжительность протеолиза следует подбирать опытным путем. Число хромосомных копий легко недооценить, когда обработка пепсином недостаточна; излишний же протеолиз может приводить к вариабельности числа хромосомных копий вследствие нарушения морфологии. Препараты некоторых опухолей (в частности, мочевого пузыря и почек) можно обрабатывать стандартным способом: 20-минутным протеолизом пепсином в концентрации 100 мкг/мл в 0,01 н. NaCl.

Если в результате протеолиза морфология клеток и тканей очень сильно нарушается, гибридизация не дает однозначных результатов, и в протокол приходится включать дополнительные процедуры (прогревание предметных стекол, фиксацию), восстанавливающие морфологию. Такой подход используется, например, при получении цитологических препаратов, отпечатков или препаратов изолированных клеток ворсинок хориона в случае лренатальной диагностики.
Гибридизация in situ: линии опухолевых клеток и разбавленные клеточные суспензии, полученные из свежих опухолей

Получение и фиксация разбавленных клеточных суспензий

Материалы
• Найлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм
• 70% этанол (-20 °С)

Методика
1. Гомогенизируют кусочки ткани, растирая их в чашке Петри, и готовят разбавленную суспензию изолированных клеток. Фильтруют суспензию через найлоновый фильтр.
2. Фиксируют профильтрованную клеточную суспензию или линию опухолевых клеток в 70% этаноле (—20 °С). Этот материал можно хранить при —20 С от нескольких месяцев до нескольких лет без ухудшения результатов гибридизации.

опухелевые клетки

Гибридизация in situ клеток опухоли

Материалы
• Предметные стекла, покрытые поли-L-лизином или силиконированные
• Пепсин из слизистой желудка поросенка (2500-3500 ЕД на 1 мг белка)
• 0,01 М НСl
• 1 % формальдегид в ФСБ
• 70%, 95%, 100% этанол
• Резиновый клей

Методика
1. Готовят клеточную суспензию с плотностью около 5 - 105 клеток/мл и раскапывают ее на предметные стекла аликвотами по 5-10мкл.
2. Высушивают препараты на воздухе в течение 15 мин.
3. Инкубируют препараты с пепсином в концентрации 50-400 мкг/мл в 0,01 М НСl в течение 20 мин при 37 С. Оптимальную концентрацию фермента следует подбирать опытным путем.
4. Промывают препараты в пяти сменах воды и пяти сменах ФСБ (в глубоких стаканах).
5. Дополнительно фиксируют клетки в 1% формальдегиде, приготовленном в ФСБ, в течение 10 мин при комнатной температуре.
6. Промывают препараты в пяти сменах ФСБ, затем в пяти сменах воды (в глубоких стаканах).
7. Дегидратируют препараты в трех сменах этанола (70, 90 и 100%), по 3 мин в каждой, затем высушивают их на воздухе.
8. Наносят на каждый препарат 5—10 мкл гибридизационной смеси, содержащей 1—3 нг зонда, накрывают покровными стеклами и промазывают стекла по периметру резиновым клеем (последнее необязательно).
9. Денатурируют 2-4 мин при 60—80 °С 10. Гибридизуют во влажной камере в течение ночи при 37 С.

Суспензии можно фиксировать при 4 °С в метаноле: уксусной кислоте (3:1) или этаноле : уксусной кислоте (3:1) и хранить при -20 °С. Оставшуюся в клетках цитоплазму можно удалить, а проницаемость клеток повысить, погрузив стекла на 10—60 с в 70% уксусную кислоту или на 15 мин в смесь 0,1 М НС1,0,05% тритон Х-100 или твин-20.

Концентрация суспензии может варьировать в зависимости от размеров образца ткани и плотности клеток, которую хотят иметь на предметном стекле.
Для лучшего прилипания клеток прогревают стекла в течение 1 ч при 80 С
Стандартная концентрация — 100 мкг/мл. Для мягкой обработки достаточно погрузить препараты на 15 мин в смесь 0,1 М НСl, 0,05% тритон Х-100 или твин-20.
После фиксации, до нанесения зонда под покровное стекло, можно промыть препараты в 2 х SSC.
Стандартные условия денатурации: 3 мин при 70 С.
Для обнаружения околоцентромерных высокоповторяющихся последовательностей достаточно гибридизации в течение 2 ч.

- Читать далее "Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей"

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: