Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей

Число работ, в которых метод ГИС применялся бы для выявления хромосомных аберраций в ядрах приготовленных рутинным способом препаратов, заключенных в парафин, весьма невелико. В первых таких работах парафинизированные препараты применялись для определения пола, при этом зондом служила Y-специфичная ДНК. Позже методом ГИС была обнаружена трисомия по хромосоме I в клетках опухоли семенников. Недавно мы сравнили число сайтов гибридизации в фиксированных этанолом препаратах разбавленных клеточных суспензий, приготовленных из опухолей мочевого пузыря, с результатами, полученными на парафиновых срезах этих же опухолей. Наилучшая корреляция наблюдалась для диплоидных переходно-клеточных карцином и низкозлокачественных опухолей. В случае анеуплоидных опухолей число сайтов гибридизации на парафиновых срезах было ниже реального числа хромосомных копий, в основном потому, что анеуплоидные ядра обычно крупнее диплоидных. Перечислим те преимущества, которые дает гибридизация in situ в случае парафиновых срезов по сравнению с изолированными опухолевыми клетками.
а. На срезах можно определить опухолевые клетки, несущие хромосомные аберрации, и провести корреляцию с гистологической картиной.
б. При получении срезов не происходит отбора клеток, как при выделении их из опухоли.
в. Гибридизация на срезах позволяет выявить гетерогенность опухоли, а также тетраплоидные клетки.
г. Можно проводить ретроспективные исследования, используя архивный материал.

Однако применение этого метода в повседневной практике ограничивается тем, что для каждого парафинового блока необходимо подбирать свой режим протеолиза. Успех гибридизации in situ во многом определяется доступностью мишени для зонда, и чтобы повысить проницаемость среза для зондов и антител, обычно проводят протеолитическую обработку пепсином или протеиназой К. Для повышения эффективности гибридизации принимают также следующие меры.
а. Удаление парафина с помощью подогретого ксилола.
б. Замораживание и оттаивание клеток.
в. Увеличение времени протеолиза.
г. Повышение температуры денатурации.
д. Обработка препарата НСl до протеолиза.

Данные о воспроизводимости результатов, полученных на большом числе серийных срезов парафиновых блоков, отсутствуют. Чтобы повысить эффективность гибридизации in situ с использованием обработки пепсином в 0,2 н. НСl для повышения проницаемости срезов, можно провести диссоциацию комплекса ДНК—гистоны или прогреть препараты в горячем (80 С) 1 М тиоцианате натрия. Подобная предварительная обработка значительно повышает результативность протеолиза, что проявляется в улучшении воспроизводимости и эффективности гибридизации in situ. В протоколе описана процедура гибридизации на приготовленных обычным способом парафиновых срезах различных опухолей: опухоли мочевого пузыря, мезотелиомы, карциномы яичников, хорионаденомы, лимфомы и др. Время протеолиза в каждом случае следует подбирать индивидуально, варьируя его от 5 мин до 1 ч. Обработка тиоцианатом натрия необязательна и может понадобиться, если в стандартных условиях гибридизация отсутствует. Условия гибридизации зависят от исследуемого типа клеток, поскольку разные клетки (опухолевые, клетки стромы или экссудата в месте воспаления) перед гибридизацией обрабатываются по-разному. Методика, описанная в протоколе, позволяет получать положительные результаты в 90% случаев.

препараты опухоли

Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей

Материалы
• Предметные стекла, покрытые поли-L-лизином и активированные глутаральдегидом
• Пепсин из слизистой желудка поросенка (2500—3500 ЕД на 1 мг белка)
• 0,2 М НС1
• 1 % Н202 в метаноле
• Ксилол
• Метанол
• 1 М тиоцианат натрия (NaSCN)

Методика
1. Готовят парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм.
2. Помешают срезы на капли дистиллированной воды при 40 С, нанесенные на предметные стекла.
3. Высушивают срезы и оставляют предметные стекла при 56 °С на ночь.
4. Удаляют парафин в трех сменах. 100% ксилола в течение 10 мин, затем в двух сменах 100% метанола, по 5 мин в каждой смене.

5. Погружают стекла на 30 мин в 1 % Н2О2 в 100% метаноле.
6. Промывают препараты в двух сменах метанола, по 5 мин в каждой, и высушивают на воздухе.
7. Чтобы повысить эффективность протеолиза, погружают препараты в 1 М NaSCN при 80 °С на 10 мин.
8. Промывают препараты в двух сменах воды, по 5 мин в каждой.
9. В течение 5—60 мин инкубируют препараты при 37 С в растворе, содержащем пепсин в количестве 4 мг на 1 мл 0,2 М НСl,

10. Промывают стекла в пяти сменах воды, затем в пяти сменах ФСБ (в глубоких стаканах).
11. Дегидратируют срезы в 70%, 90% и 100% этаноле, по 3 мин в каждом, затем высушивают на воздухе.
12. Наносят на препарат 10—15 мкл гибридизационной смеси, накрывают покровным стеклом и промазывают стекла по периметру резиновым клеем.
13. Денатурируют зонды и мишени при 80 С в течение 4-10 мин.
14. Проводят гибридизацию во влажной камере в течение ночи при 37С.

- Читать далее "Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли"

Оглавление темы "Диагностика опухолей. Исследование опухолей":
1. Мечение зондов для выявления опухолевых клеток. Отмывание препаратов после гибридизации
2. Иммуноцитохимическая детекция опухоли. Детекция опухоли в парафиновых срезах
3. Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли
4. Парафинизированные препараты опухолевых тканей. Гибридизация in situ на парафиновых срезах опухолей
5. Замороженные срезы опухоли. Гибридизация in situ на замороженных срезах опухоли
6. Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли<
7. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование опухоли. Проточная цитометрия опухоли
8. Рак мочевого пузыря, молочных желез. Опухоли яичек, желудка
9. Определение гетерогенности опухолей. Выявление клеточных мРНК
10. Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: