Считается, что тетраплоидизация — критический процесс в развитии многих солидных опухолей, при котором случайная или неслучайная утрата хромосом может привести к отбору и размножению анеуплоилных клеток. Это наводит на мысль, что в таких опухолях присутствуют популяции клеток разной плоидности. Для исследования гетерогенных опухолей можно использовать методы интерфазной нитогенетики — весьма простой и доступный инструмент.
Это позволяет установить корреляцию между генетическими аберрациями и гистологическими особенностями опухолей.
а. Методами интерфазной цитогенетики можно выявить тетраплоидизацию опухолей, в которых по данным проточной цитометрии никакой анеуплоидии не наблюдается.

б. Эти методы позволяют обнаруживать «минорные» клеточные популяции в «диплоидных» опухолях, а также в опухолях, претерпевших тетраплоидизацию. При раке мочевого пузыря минорные фракции можно выявить по удвоению количественных хромосомных аберраций по сравнению с основной популяцией опухолевых клеток. Например, в клетках одной из минорных популяций, присутствующих в диплоидной переходно-клеточной карциноме, обнаружены четыре хромосомы 1 и две хромосомы 9, а в клетках основной популяции —две хромосомы 1 и одна хромосома 9.

в. Для выявления хромосомного несоответствия в минорной популяции опухолевых клеток можно использовать гибридизацию in situ с двумя мишениями, локализованными на разных хромосомах,

В этих статьях мы суммировали разные методики, с помощью которых можно исследовать клетки, выделенные из только что удаленных опухолей, а также парафиновые или криостатные срезы этих опухолей. Интерпретация результатов зависит в основном от способов обработки препаратов перед гибридизацией, а не от природы зонда. Мы использовали в своей работе зонды, специфичные в отношении высокоповторяющихся последовательностей. Для выявления аномалий в области коротких или длинных плеч хромосом нужны другие зонды, например фаговая ДНК, космиды, плазмиды или искусственные хромосомы дрожжей.

Выявление клеточных мРНК

Метод гибридизации in situ позволяет определить клеточную локализацию специфических нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с помощью меченых комплементарных зондов. Впервые этот метод был предложен в 1969 г. и вначале применялся для выявления ДНК, а сейчас его используют и для локализации мРНК. Это дает возможность получать очень ценную информацию об экспрессии генов в клетке и о синтезе в ней определенных белков. Для выявления мРНК применяют разные зонды: одно- и двухцепочечные ДНК, олигонуклеотиды, комплементарную РНК. При этом РНК-зонды обладают рядом преимуществ по сравнению с зондами других типов. Так, они имеют известный размер, не содержат векторных последовательностей, образуют специфические термостабильные дуплексы РНК—РНК, при работе с ними можно удалять негибридизовавшуюся РНК с помощью РНКазы.

Все это существенно повышает специфичность и чувствительность гибридизации. В этой главе мы рассмотрим практические аспекты применения РНК-зондов (в первую очередь изотопно меченных) для локализации мРНК в клинических препаратах.

Для получения одноцепочечных антисмысловых, или кРНК-, зондов необходимо использовать специальные транскрипционные векторы, которые содержат один или два узнаваемых РНК-полимеразами промотора, обеспечивающих транскрипцию мРНК с субклонированной в вектор вставки. С 3'-стороны от промоторов

РНК-полимераз расположен полилинкер, позволяющий легко проводить субклонирование ДНК. Для получения специфических кРНК кДНК-матрица должна иметь в транскрипционном векторе ориентацию, обратную к ориентации промоторных участков.

Векторы pGEM и Bluescribe содержат полилинкер, который фланкирован промоторами, узнаваемыми РНК-полимеразами. Это дает возможность проводить транскрипцию ДНК-вставки в обоих направлениях, получая при этом как антисмысловые (зонды, комплементарные мРНК), так и смысловые (зонды, идентичные мРНК) РНК-последовательности в зависимости от того, какая полимераза используется.

- Читать далее "Линеаризация вектора для определения мРНК. Транскрипция in vitro и мечение зондов мРНК"