РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов

Один из эффективных способов получения одноцепочечных РНК-зондов, специфичных к определенным последовательностям ДНК. основан на клонировании последовательности, примыкающей к промотору фага SP6. Векторы для клонирования и РНК-полимераза SP6 имеются в продаже. Процедура мечения зондов биотином с помощью РНК-полимеразы SP6 описана в протоколе.

Большинство зондов можно получить, используя нерадиоактивные гаптены, присоединенные к нуклеотидам. Чаше всего при синтезе РНК заменяют уридин его аналогами, а затем к каждому аналогу присоединяют биотин. В другом варианте в РН К включают UTP, уже меченный биотином или дигоксигенином.

Мечение кРНК-зондов биотином

Материалы
• 5 х буфер для транскрипции: 200 мМ трис-HCI, рН 7,5; 30 мМ MgCl2; 10 мМ спермидин; 0,05% БСА
• Смесь немеченых NTP: по 2,5 мМ ATP, CTP и GTP в 20 мМ трис-HCI, рН 7,5
• Свежеприготовленный 0,2 М ДТТ
• РНК-полимераза фага SP6
• 10 мМ аллиламин-UTP
• Ингибитор рибонуклеазы из плаценты человека

• N-гидроксисукцинимилбиотин (NHS-d-biotin фирмы Sigma, UK)
• 0,1 М борат натрия, рН 8,4
• 5 М ацетат аммония
• 3 М ацетат натрия, рН 5,2
• БуферТЭД: 10 мМ трис-НС1, рН 8,0; 10 мМ ЭДТА; 10 мМ ДТТ

рнк зонды

Методика
1. Реакцию проводят при комнатной температуре, поскольку на льду в присутствии спермидина ДНК может выпасть в осадок. Смешивают по очереди следующие реагенты:
• 5 х буфер для транскрипции
• 0,2МДТТ
• Смесь немеченых трифосфатов
• Аллиламин-UTP
• Ингибитор рибонуклеазы из плаценты человека
• Линеаризованная ДНК-матрица
• Вода, обработанная ДЭПК

2. Добавляют 10 ЕД РНК-полимеразы фага SP6 (обычно 1 мкл).
3. Инкубируют 1 ч при 37 С.
4. Добавляют 4 мкл 5 М ацетата аммония и 40 мкл этанола и выдерживают смесь для осаждения РНК 30 мин при —80 С или в течение ночи при -20 °С.
5. Центрифугируют при 15 000 g 20 мин и удаляют водный слой.
6. Снова растворяют продукт в 50 мкл 0,1 М бората натрия, рН 8,4.
7. Растворяют 2 мг N-гидроксисукцинимидбиотина в 200 мкл N,N-диметилформамида и добавляют по 10 мкл смеси в каждую пробирку.
8. Инкубируют при комнатной температуре 2 ч.
9. Осаждают РНК, добавив 25 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 250 мкл охлажденного абсолютного этанола и выдерживают раствор в течение ночи при -20 С.
10. Центрифугируют при 15 000 g 20 мин. Осторожно удаляют супернатант и растворяют осадок в 50 мкл буфера ТЭД; хранят при -20 С.

Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов

Олигонуклеотиды можно пометить либо методом 3'-, 5-концевого мечения, либо с помощью какой-либо аминосвязывающей группы.

Биотин, флуорохромы или щелочную фосфатазу можно пришить к какому-либо модифицированному основанию, несущему соответствующее линкерное плечо, и включить это основание непосредственно в олигонуклеотиды, синтезируемые в автоматическом ДНК-синтезаторе. Метку можно пришить и к первичной аминогруппе линкерного плеча с помощью аминореактивного бифункционального кросс-линкера. Используя олигонуклеотиды, меченные биотином или флуорохромами описанным способом, мы получили более слабые гибридизационные сигналы, чем в том случае, когда мечение проводилось обычным методом. Впрочем, предварительные результаты с использованием в качестве метки кислой фосфатазы были весьма многообещающими.

- Читать далее "ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: