Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ

Здесь может играть роль один или сразу несколько факторов:
• неспецифическое связывание зонда;
• неспецифическое связывание антител с авидином;
• неспецифическое связывание субстрата.

Неспецифическое связывание зонда. Меченые зонды (особенно рибонуклеиновые кислоты) могут неспецифически связываться с клетками разных типов, например, часто наблюдается связывание с эозинофилами. Зонды, меченные биотином, могут связываться с эндогенным авидином или (поскольку при нейтральных рН биотин заряжен положительно) с белками внеклеточного матрикса. Для других молекул-свидетелей, например дигоксигенина, такой проблемы не существует. Особенно сильное неспецифическое связывание (прежде всего с ядерными структурами) характерно для коротких (менее 200 п.н.) зондов. Эту причину повышения фона легко устранить, контролируя с помощью блот-гибридизации по Саузерну размер зонда.

Неспецифическое связывание антител с авидином. Такое связывание обычно происходит, если не были приняты специальные меры для его предотвращения. Так, полноразмерные антитела способны связываться с Fc-рецепторами клеточной поверхности, и это связывание можно уменьшить, если использовать их F(ab)2-фрагменты. Для ослабления неспецифического связывания, обусловленного электростатическими взаимодействиями, можно провести предварительную инкубацию с бычьим сывороточным альбумином или, если этого окажется недостаточно, с антисыворотками человека или животных. Связывание авидина уменьшается при инкубации в обезжиренном молоке или при использовании модифицированного авидина — стрептавидина, который при рН 7 не заряжен.

Неспецифическое связывание субстрата. Такое связывание наблюдается при:
• наличии эндогенной ферментативной активности;
• спонтанном изменении субстрата;
• связывании субстрата с внеклеточными компонентами среза.

Чаще всего в препаратах присутствует эндогенная пероксидаза. Для блокирования эндогенной щелочной фосфатазы (эта проблема, правда, возникает реже) в раствор субстрата вводят левамизол, не ингибирующий щелочную фосфатазу кишечника. Спонтанное изменение особенно часто наблюдается для субстратов пероксидазы, но его нельзя исключить и для некоторых субстратов щелочной фосфатазы, например быстрого красного TR. Вероятность нежелательного изменения субстрата можно уменьшить, готовя субстраты непосредственно перед их нанесением на срез. Связывание субстрата с внеклеточными компонентами наблюдается особенно часто при анализе мазков шейки матки; если не принять необходимых мер, то взаимодействие субстрата щелочной фосфатазы НСТ/БХИФ с муцинами приведет к сильному фоновому окрашиванию.

гибридизация in situ

Оборудование для гибридизации in situ

Для проведения процедуры гибридизации in situ как таковой нужно сравнительно простое оборудование. Самое сложное в этой методике — получение, очистка и мечение зондов. Кроме того, все больше разнообразных зондов появляется в продаже (например, их можно приобрести у фирм Cambridge Research Biochemicals, UK, и Clontech, UK), если не в меченом виде, то в виде достаточно чистой для проведения мечения ДНК. Для анализа замороженных срезов и срезов залитых в парафин тканей требуется следующее оборудование:
• емкости для хранения в жидком азоте или морозильник на —70 С;
• морозильник на —20 С;
• холодильник на +4 С;
• термостаты суховоздушные на 95 и 42 С;
• водяные бани;

• инкубационные камеры;
• автоматические микропипетки на 5 мкл - 1 мл;
• кюветы для окрашивания и держатели для предметных стекол;
• меченые зонды или плазмиды либо все необходимое для их мечения и очистки;
• реактивы для гибридизации и отмывания;

• первые и контрольные антитела;
• вторые и третьи антитела и реактивы;
• реактивы для приготовления буферов и субстратов;
• все необходимое для защиты от радиоактивного излучения;
• красители и среды для монтирования срезов.

- Читать далее "Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: