Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов

Для препаратов, приготовленных из суспензии клеток в буфере с помощью центрифугирования, характерно равномерное распределение клеток и прекрасная морфология. Можно использовать также культуру клеток, суспендированную в буфере без антибиотиков.

Препараты для гибридизации in situ, приготовленные с помощью центрифугирования:
1. Собирают клеточный материал двух последовательных соскобов, полученных с помощью шпателя или щеточки, в пробирку с 20-50 мл ФСБ, содержащего гентамииин (50 мМ фосфатный буфер, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 100 мкг/мл гентамицина).
2. Хранят образцы при +4 С не более суток.
3. Встряхивают пробирку несколько раз, чтобы снять клетки со шпателя или щеточки, и вынимают последние из пробирки.

4. Центрифугируют суспензию при 1500g 10 мин.
5. Аккуратно отсасывают супернатант пастеровской пипеткой.
6. Ресуспендируют клетки в 10 мл ФСБ, вновь центрифугируют и сливают супернатант.
7. Еше раз суспендируют клетки в 1 мл этого же буфера и переносят суспензию в пробирку фирмы Эппендорф для микроцентрифугирования.

биоптаты при гибридизации

8. Центрифугируют 2 мин и удаляют супернатант.
9. Оценивают количество клеток и ресуспендируют их в соответствующем объеме буфера ТЭ (10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5), содержащем 100 мМ NaCl. Для получения монослоя нужно примерно 20 000—30 000 клеток на одно предметное стекло.
10. Предварительно смоченные фильтры накладывают на стекла, помещенные в центрифугу со 100 мкл ТЭ.
11. Добавляют к 100 мкл ТЭ 10 мкл клеточной суспензии и центрифугируют при 300 g 5 мин для осаждения клеток на стеклах.
12. Высушивают стекла при комнатной температуре.

13. 10 мин фиксируют клетки в ПЛПГ или в фиксаторе Карнуа.
14. Быстро споласкивают препараты водой и высушивают на воздухе.
15. Хранят препараты до гибридизации in situ при —20 С.

Биоптаты для выявления вирусов

При оптимизации процессов приготовления препаратов и фиксации сохраняется максимальное количество клеточной РНК- или ДНК-мишени без существенного изменения морфологии. Полное сохранение морфологии обеспечивают соответствующие фиксаторы, однако при этом уменьшается проницаемость препарата для зонда. В отличие от ДНК, мРНК в клетке постоянно синтезируются и разрушаются ферментами, так что время жизни конкретной мРНК может быть относительно мало. Соответственно для точной локализации мРНК биоптат следует немедленно фиксировать или заморозить, а при интерпретации результатов гибридизации in situ — принимать во внимание, сколько времени прошло с момента получения биоптата до его фиксации.

а. Криостатные срезы. Для локализации мРНК мы предпочитаем фиксировать ткани забуференным 4% параформальдегидом; для небольших биоптатов достаточно 2—4-часовой фиксации. Перед замораживанием ткань погружают в сахарозу, чтобы уменьшить артефакты, и хранят до приготовления срезов в жидком азоте. Ткань можно заморозить сразу же после биопсии и затем тоже хранить в жидком азоте. В криостате при -20 "С получают толстые срезы (4—5 мкм) и помещают их на подготовленные нужным образом предметные стекла. Эти срезы фиксируют 10 мин 4% параформальдегидом, высушивают на воздухе и хранят до гибридизации при —80 °С.

Для выявления ДНК получают криостатные срезы толщиной 5-10 мкм при температуре —20 °С и помещают их на предметные стекла. Стекла высушивают на воздухе и погружают в подходящий фиксатор, например в 4% параформальдегид (0 С, 10 мин) или ПЛПГ (0 С, 10 мин).

б. Препараты, фиксированные формалином и заключенные в парафин. Препараты, полученные при хирургических операциях, обычно фиксируют формалином. В нашей лаборатории фиксированный формалином и заключенный в парафин материал в основном используется для обнаружения вирусной ДНК. Оптимальное время фиксации зависит от размеров биоптата, но не должно превышать 24 ч. При длительном, в течение нескольких дней или недель, хранении материала в формалине между нуклеотидами и аминокислотами ядерных белков образуются ковалентные связи, что препятствует денатурации ДНК. Хорошие результаты получаются при фиксации 4% водным раствором формалина при комнатной температуре в течение 4 ч, а также фиксатором Боуэна (пикриновая кислота, формальдегид, уксусная кислота в соотношении 15:5:1) или ШШГ за 3-6 ч до заключения материала в парафин. Однако, по некоторым данным, фиксатор Боуэна значительно ослабляет гибридизационный сигнал, явно проигрывая в этом отношении нейтральному 10% формалину. Небольшие биоптаты можно фиксировать 70% этанолом в течение 24 ч перед заключением в парафин. Это позволяет анализировать их с помощью иммуноцитохимических методов.

- Читать далее "Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: