Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ

Используя один и тот же срез, последовательно проводят иммуноцитохимию и неизотопную ГИС. Моноклональные первые антитела выявляют с помощью ЩФАЩФ, а ДНК-гибриды — с помощью пероксидазы.

Впрочем, можно использовать и другие способы детекции.
1. При необходимости демаскируют антигены с помощью соответствующих ферментов (например, трипсина), а затем блокируют срез с помощью БСА или антисывороток.
2. Наносят на срез первые антитела, разведенные в ТСБ до нужного титра, и инкубируют его 30 мин при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °С.
3. Промывают два раза по 5 мин в ТСБ.
4. Инкубируют в ТСБ в течение 20 мин с кроличьими антителами к белкам мыши при оптимальном разведении.

5. Промывают два раза по 5 мин в ТСБ.
6. Инкубируют 20 мин с разведенным в ТСБ ЩФАЩФ-комплексом.
7. Промывают два раза по 5 мин в ТСБ.
8. Для усиления сигнала можно повторить этапы 5—8, сократив время инкубации до 10 мин. 9. Выявляют сигнал с помощью НСТ/БХИФ, тщательно промывают срез в воде.

гибридизация in situ

Б. Гибридизация in situ
1. Демаскируют нуклеиновые кислоты с помощью ограниченного протеолиза.
2. Проводят гибридизацию с зондом, меченным дигоксигенином или биотином.
3. Отмывают срез после гибридизации.
4. Детектируют гибриды с помощью авидина—пероксидазы и АЭК/Н2О2 в случае биотинилированных зондов или с помощью трехступенчатой системы детекции с использованием АЭК/Н2О2 в качестве индикатора в случае зондов, меченных дигоксигенином.

Многократная гибридизация in situ

Иногда проводят двойную и тройную гибридизацию in situ. Такой прием применяется особенно часто в тех случаях, когда препараты представляют большую ценность или когда исследуются взаимоотношения между нуклеиновыми кислотами, например внутри одного ядра. Принципы, которые при этом используются, не отличаются от таковых при комбинировании иммуноцитохимии и гибридизации in situ.

Использование метода гибридизации in situ для диагностики заболеваний. Метод ГИС пригоден для выявления любой нуклеиновой кислоты при условии, что существует подходящий зонд. Наибольший интерес представляет: а) выявление в клиническом материале вирусных нуклеиновых кислот; б) определение хромосомоспецифичных последовательностей в интерфазном ядре; в) локализация в клиническом материале специфических мРНК. Более подробно все эти вопросы мы рассмотрим в следующих статьях.

- Читать далее "Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: