ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Меченые зонды получают и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя как радиоактивные, так и нерадиоактивные метки. ПЦР-зонды имеют заданную длину, определенную нуклеотидную последовательность, они высокоспецифичны и могут быть как одно-, так и двухцепочечными. В результате ПЦР происходит амплификация сегмента ДНК, расположенного между участками с известной последовательностью нуклеотидов. При этом праймерами в цепи реакций, катализируемых полимеразой Taq, служат олигонуклеотиды. Реакционный цикл включает денатурацию, отжиг праймеров и синтез ДНК. Процедура получения биотинилированных зондов с помощью ПЦР, предназначенных для выявления вируса папилломы человека, описана в протоколе.

При биотинилировании важно поддерживать определенное соотношение между биотинилированным dUTP и dTTP. Максимальный выход достигается при концентрациях dTTP и биотинилированного dUTP 150 мкМ и 50 мкМ соответственно. Объем реакционной смеси можно увеличить до 250 мкл, при этом выход биотинилированного ПЦР-зонда остается прежним.

Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека:
• 5 х ПЦР-буфер: 10 мМ трис-HCl, рН 8,3 (при 25 °С), 500 мМ КС1, 15мМ МgС12
• Bio-11-dUTP (Sigma, UK), растворенный в 100 мМ трис-HCl, 0,1мМ ЭДТА,рН7,5
• По 10 мМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP

• По 50 мкл праймеров 1 и 2
• Полимераза Tag (Perkin—Elmer Cetus, USA; 5 ЕД/мкл)
• Гликоген: 10 мг/мл
• Агароза: 10 мг/мл
• 2,5 М ацетат натрия, рН 5,2
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

вирусы при гибридизации
Методика

1. В микроиентрифужную пробирку, помещенную на лед, вносят по очереди следующие компоненты.
• ДНК-мишень 0,2 фмоль (1—10 нг плазмиды длиной 8 т.п.н.)
• 0,3 мМ bio-11-dUTP 8,3 мкл
• Праймер 1 (50 мкМ) 1 мкл
• Праймер 2 (50 мкМ) 1 мкл
• Полимераза Tag 1 мкл
• Дистиллированная вода до 50 мкл

2. Добавляют в пробирку 50 мкл вазелинового масла.
3. Проводят 40 циклов ПЦР в термоциклере в следующих условиях:
• предварительная денатурация при 95 "С в течение 5 мин;
• денатурация при 95 "С в течение 30 с;
• отжиг при 55 °С в течение 30 с;
• амплификация при 72 °С в течение 60 с.

4. В конце 40-го цикла время амплификации увеличивают на 5 мин.
5. Добавляют 1 мкл гликогена, 5 мкл 2,5 М ацетата натрия, рН 5,2, и ПО мкл этанола. Инкубируют в течение ночи при -20 °С.
6. Центрифугируют на микроцентрифуге при максимальной скорости в течение 15 мин.
7. Высушивают содержимое пробирки под вакуумом.

8. Растворяют осадок в 50 мкл ТЭ.
9. Степень биотинилирования зонда определяют с помощью электрофореза: биотинилированный ПЦР-продукт движется медленнее небиотинилированного. ПЦР-продукт переносят на фильтр по Саузерну и выявляют с помощью комплекса стрептавидин/кислая фосфатаза, как это описано в протоколе.

Максимальная концентрация зонда определяется тем его количеством, которое имеется в распоряжении исследователя, и соотношением сигнал/фон.
Во всяком случае она должна быть выше, чем при гибридизации на фильтрах: если для гибридизации in situ применяется радиоактивный зонд, полученный методом ник-трансляции, то его конечная концентрация в буфере для гибридизации должна составлять 0,5—1 мкг/мл, а если зонд биотинилирован, то она должна быть выше: 1—5 мкг/мл.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: