Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов

Сейчас в качестве меток при гибридизации in situ используют биотин, дигоксигенин, динитрофенол, ртуть, ацетиламинофлуорен и сульфонированные нуклеотиды. Долгое время считалось, что нерадиоактивные зонды не обеспечивают столь высокой чувствительности, как радиоактивные, но с разработкой более совершенных систем детекции ситуация изменилась. Есть данные, что метод гибридизации in sutu с использованием нерадиоактивных зондов не менее чувствителен, чем с использованием радиоактивных.

Меченые ДНК-зонды можно получить несколькими способами. Наиболее популярный из них — метод ник-трансляции. Для этого можно использовать как специфическую ДНК в чистом виде, так и эту же ДНК в составе плазмидного вектора. Процедура получения 35S-зондов с помощью ник-трансляции описана в протоколе. Биотинилируется около 30% ДНК, при этом bio-11-dUTP предпочтительнее bio-16-dUTP или bio-7-dATP. Наборы для ник-трансляции и детекции производят многие фирмы. Хорошие результаты дает дот-блот-гибридизация с ДНК в количестве порядка 10 пг, Обычно мы берем пятикратные количества ДНК (5 мкг) и реакционной смеси (250 мкл) по сравнению с приведенными в протоколе. Как показывает наш опыт, биотинилированные зонды можно хранить по меньшей мере 2 года. Ник-трансляцию можно проводить и при десятикратных пропорциях, однако степень биотинилирования при этом оказывается ниже.

Получение S-зондов с помощью ник-трансляции А.
• Раствор нуклеотидов: по 0,3 мМ dATP, dTTP, dGTP в 500 мМ трис-HCl, рН 7,8; 50 мМ MgCl2; 100 мМ 2-меркаптоэтанол; 100 мкг/мл не содержащего нуклеаз БСА
• 35S-dCTP (20 мкКи/мкл)
• Стерильная дистиллированная вода
• Смесь ДНКаза 1/ДНК-полимераза I: 0,5 ЕД/мкл ДНК-полимеразы I, 10 пг/мкл ДНКазы I в смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ацетат магния, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 50% глицерин, 100 мкг/мл очищенного от нуклеаз БСА

Методика 1. В коническую полипропиленовую пробирку емкостью до 1,5 мл, помещенную в ледяную баню, добавляют по очереди следующие реагенты.

• Раствор ДНК 1 мкг
• Раствор нуклеотидов 10 мкл
• 35S-dCTP 16,6 мкл
• Смесь ДНКаза 1/ДНК-полимераза 1 8 мкл
• Стерильная дистиллированная вода до 50 мкл

зонды для выявления вирусов

2. Плотно закрывают пробирку и осторожно перемешивают содержимое, перевернув ее несколько раз. Центрифугируют на микроцентрифуге в течение нескольких секунд, чтобы содержимое осело на дно пробирки. Стараются избегать сильного встряхивания, чтобы не уменьшить активность ферментов.
3. Инкубируют при 15 С в течение 2 ч.
4. Помещают пробирку на лед.

Б. Очистка
Материалы
• Пробирки (Sorvale Istruments No. 032400)
• Пробки для них (Sorvale Instruments No. 032400)
• Колонки (Bio-Rad No. 731-1550)
• Сефадекс G-50: мелкодисперсный, в 1 х SSC, 0,1% ДСН
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Буфер для колонки: 300 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, рН 7,5, 0,1% ДСН, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5,5 мМ дитиотрейтол (ДТТ)
• Бромфеноловый синий
• Дрожжевая тРНК (10 мг/мл)
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА

Методика
1. Наполняют 3-сантиметровую колонку сефадексом G-50 следующим образом:
• пипеткой вносят в колонку 5 мл сефадекса G-50;
• пропускают 1 мл буфера для колонки.

2. Добавляют к образцу 1 мл буфера для колонки и 50 мкл бромфенолового синего.
3. Пропускают образец в 1 мл буфера через колонку, собирая всю жидкость, проходящую через колонку, до тех пор, пока не будет достигнута отметка 1,2 мл.
4. К элюату добавляют 2 капли дрожжевой тРНК. Общий объем элюата должен составить 2—3 мл.
5. Для осаждения ДНК добавляют 7—8 мл (2,5 объема) абсолютного этанола.
6. Выдерживают смесь при -70 С от 20 мин до 2 ч или оставляют на ночь при -20 С.

7. Центрифугируют при 14 000 g 20 мин при 4 С.
8. Сливают этанол и подсушивают осадок.
9. Снова растворяют осадок в 200—250 мкл ТЭ.
10. Переносят образцы в микроцентрифужные пробирки.
11. Растворяют 1 мкл меченого зонда в 4 мл сцинтиллятора и измеряют радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

- Читать далее "РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: