Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов

В отличие от гибридизации на твердых подложках гибридизация in situ позволяет локализовать специфические нуклеотидные последовательности непосредственно в клетках или тканевых срезах. Этот метод разработали в 1969 г. Пардю и Голл и независимо от них Джонс и др.

Сейчас гибридизационные методы успешно дополняют рутинные методы диагностики, позволяя идентифицировать в культурах тканей и клеток самые разные микроорганизмы. Иммуноцитохимические методы выявления антигенов и детекция антител с помощью ферментного иммуносорбентного метода (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay, ELISA) или радиоиммунологического анализа (РИА) применяются в диагностике уже давно, а в последнее время все более широкое распространение находит высокоспецифичный и чувствительный метод гибридизации in situ.

Принципы метода гибридизации in situ аналогичны таковым для метода блот-гибридизации: зонд наносят прямо на образец, содержащий генетический материал, который иммобилизован в твердом субстрате (в данном случае в интактной клетке). Срез ткани, фиксированный на предметном стекле, обрабатывают протеазой и/или кислотой, чтобы зонд мог достичь ядерной ДНК, предварительно денатурированной нагреванием. Если в срезе присутствует ДНК, комплементарная зонду, происходит гибридизация.

Не связанный меченый зонд или ошибочно спарившуюся ДНК удаляют интенсивным промыванием препарата, а связавшийся зонд детектируют иммуногистохимическими методами или с помощью радиоавтографии. Таким способом удается идентифицировать ДНК, локализованную в отдельных хромосомах, клетках и тканях. Нуклеиновой кислотой-мишенью может быть и мРНК, обычно представленная большим числом копий, чем ДНК. Оптимальные условия гибридизации с ДНК- и РНК-зондами для разных ситуаций описаны в работах.

Подготовка предметных стекол для выявления вирусов

Основная проблема, которая возникает при гибридизации in situ, — отлипание срезов от предметных стекол. Обычно стекла покрывают различными адгезивами, в частности поли-L-лизином, желатиной с алюмохромовыми квасцами, подкисленным раствором Денхардта. При этом для достижения эффективной адгезии мол. масса поли-L-лизина должна быть выше 150 000. К сожалению, ни один из этих адгезинов не подошел для наших опытов, особенно в случае фиксированных формалином, заключенных в парафин биоптатов и/или больших по площади тканевых срезов. Примерно 20 лет назад был разработан метод связывания биохимически активных лигандов с неорганическими субстратами.

Этот метод с помощью реагентов на основе органосилана мы попытались использовать для прикрепления к стеклу тканевых срезов или клеток. Модифицировав органосилановый метод, предложенный в работе, мы достигли 100%-ного прилипания ткани к стеклам без каких-либо артефактов.

Мазки готовят из клинического материала или из культуры клеток. Клетки наносят тонким слоем на маркированную часть предметного стекла, покрытого адгезивом, высушивают на воздухе и сразу же фиксируют в течение 10 мин в охлажденном ацетоне или в 95% этаноле. Клетки прекрасно сохраняют свою морфологию при фиксации периодат-лизин-параформальдегид-глутаральдегидом (ПЛПГ) или фиксатором Карнуа (60% хлороформ, 30% этанол, 10% уксусная кислота). Еще лучшие результаты можно получить, используя для приготовления препаратов так называемую клеточную центрифугу.

выявление вирусов

Приготовление периодат-лизин-параформальде-гид-глутаральдегидного фиксатора

1. Готовят маточный раствор лизинового буфера (0,1М лизин, 50MMNa2HPO4, pH 7,4):
• растворяют 18,3 г лизинмоногидрохлорида и 13,4 г Na2HP04*7Н20 в 1 л воды;
• доводят рН до 7,4 с помошью НС1 и хранят при 4 °С.

2. Готовят 4% (в/о) параформальдегид:
• растворяют 20 г параформальдегида в 500 мл деионизо-ванной воды;
• нагревают раствор до 60 С, пока осадок параформальдегида частично не растворится, и по каплям (1 капля/10 мин) добавляют 10 М NaOH до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

3. Готовят 8% глутаральдегид, разводя 10 мл 50% маточного раствора в 52,5 мл дистиллированной воды.
4. Готовят фиксатор ПЛПГ, смешивая следующие компоненты:
• 60 мл лизинового буфера;
• 10 мл 4% параформальдегида;
• 62,5 мл 8% глутаральдегида;
• добавляют 160 мг метапериодата натрия и перемешивают 10 мин.

- Читать далее "Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: