Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ

Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого сигнала, во всех случаях необходимо ставить адекватные контрольные опыты, как положительные, так и отрицательные.

Положительные контроли аналогичны используемым в иммуноцитохимии. Их можно разделить на две категории: тканевой контроль и контроль собственно метода. Так, в специфичности зонда позволяет убедиться гибридизация с тканью, заведомо содержащей искомую последовательность. При этом лучше использовать ткани, в которых интересующая исследователя ДНК или РНК присутствует в умеренных количествах: определяя величину гибридизационного сигнала на контрольном срезе, таким способом можно оценить чувствительность метода. Последняя может снижаться при слабом мечении нуклеиновой кислоты-зонда или недостаточном демаскировании последовательностей-мишеней, Чтобы убедиться в нормальном ходе денатурации и гибридизации, можно использовать в качестве зонда суммарную геномную ДНК человека.

Отрицательные контроли. В них обычно не применяют ткани, вообще не содержащие последовательность-мишень, поскольку условия гибридизации в столь разных тканях существенно различаются и прямое сравнение полученных результатов будет некорректным. Для определения специфичности полезно обрабатывать последовательности-мишени ДНКазой или РНКазой; мы рекомендуем применять эту процедуру в повседневной практике. Гибридизация с меченым вектором такого же размера, как зонд, позволит исключить возможную неспецифическую гибридизацию вектора с исследуемой тканью, а гибридизация с гомологичными (но не идентичными) зонду последовательностями — оценить специфичность и жесткость используемых условий гибридизации. Более подробно этот способ контроля мы обсудим в разд. 7.3 гл. 9, где рассматриваются методы обнаружения вируса папилломы человека. Проводя гибридизацию «положительных» срезов со смесью меченого и немеченого зондов при 1000-кратном избытке последнего, можно оценить специфичность гибридизации по конкуренции зондов обоих типов за последовательность-мишень.

гибридизация in situ

Если конкурентная гибридизация идет, то при большом избытке немеченого зонда будет наблюдаться существенное ослабление гибридизационного сигнала или полное его исчезновение. Это указывает не только на идентичность зонда последовательности-мишени, но в первую очередь на то, что условия гибридизации обеспечивают необходимую специфичность. При постановке такого контроля важно использовать ник-трансляцию (но без метки) и для получения немеченого зонда — в результате спектр размеров у обоих зондов будет совпадать и условия их гибридизации будут одинаковыми. Если немеченый зонд будет слишком большого размера, он не сможет успешно конкурировать с меченым зондом и подавлять его гибридизацию. При ГИС с РНК для контроля специфичности гибридизационного сигнала применяют смысловые зонды. Контроль системы детекции проводится так же, как в иммуноцитохимии.

Сохранность срезов на предметных стеклах определяется соотношением между величиной адгезии, зависящей от предварительной обработки предметных стекол, и степенью разрушения белков межклеточного матрикса в ходе протеолиза, которая частично зависит от характера изучаемой ткани. Таким образом, растрескивание срезов можно уменьшить, либо увеличив адгезию, либо проводя протеолиз в более мягких условиях. Мы покрываем все предметные стекла аминопропилтриэтоксисиланом, а также изменяем условия демаскирования — либо используем другой фермент, либо уменьшаем концентрацию фермента. Все это, однако, может приводить к снижению чувствительности метода. Нарушение морфологии тканей обычно происходит в результате либо чрезмерного протеолиза срезов, либо слишком сильного их нагревания при денатурации.

Отсутствие сигнала в случае положительного контроля может обусловливаться разными факторами — от недостаточного мечения зонда до случайного пропуска этапа инкубации с антителами. Если сигнал слабый, значит, метод в принципе работает, но один или несколько его этапов не оптимизированы. Например, зонд может быть недостаточно хорошо помечен или иметь слишком большой размер и плохо проникать в клетку. Среди других причин слабого сигнала необходимо отметить неадекватное демаскирование, недостаточную денатурацию, низкое качество антител. Как показывает наш опыт, чаще всего имеет место неадекватное демаскирование, обусловленное или спонтанной инактивацией фермента при его хранении, или различием в активности ферментов из разных партий. Если сигнал слишком слабый, мы прежде всего проверяем уровень мечения зонда и его размер и, убедившись, что с этим все в порядке, повторяем эксперимент с другой партией демаскирующего фермента.

Невоспроизводимость положительного результата гибридизации может иметь две причины: либо первый эксперимент дал ложноположительный результат, либо второй эксперимент оказался неудачен в чисто техническом отношении. Для исключения второй причины каждый эксперимент необходимо сопровождать соответствующими контролями, и если обнаружится, что результат не воспроизводится по техническим причинам и при повторных опытах сигнал опять отсутствует или является очень слабым.

- Читать далее "Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: