Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание

К реактивам предъявляются такие же требования, как и при проведении иммуноцитохимических исследований. Особая аккуратность необходима при работе с зондами: загрязнение препаратов РНКазами или ДНКазами может привести к их расщеплению. Следует отметить также, что растворы для гибридизации и отмывания содержат токсичный и обладающий мутагенным эффектом формамид.

Методы неизотопной детекции достаточно легко автоматизировать с помощью применяемого в иммуноцитохимии оборудования. Труднее поддаются автоматизации процессы подготовки гибридизационных растворов, процедуры денатурации и гибридизации; ко времени написания этого обзора были сделаны только первые попытки такого рода. Автоматизированная система, основанная на использовании капиллярных сил, не нашла широкого применения в основном вследствие высокой вязкости гибридизационной смеси из-за присутствия в ней декстрансульфата. Впрочем, при работе с большим числом срезов автоматизация одной только детекции может сберечь много сил и времени.

Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание

Комбинируя гибридизацию in situ с обычным гистологическим окрашиванием, необходимо соблюдать два условия. Во-первых, вещества, с которыми связываются красители, не должны разрушаться под действием протеаз и при повышении температуры. Во-вторых, цвета, получаемые при окрашивании и при детекции гибридизационного сигнала, должны контрастировать. В связи с этим при проведении ГИС для окрашивания обычно используют гематоксилин, позволяющий выявить общую морфологию ткани, но можно применять и другие удовлетворяющие описанным выше требованиям красители.

гибридизация in situ

Гибридизация in situ и иммуноцитохимия

В этом случае необходимо подобрать условия, удовлетворяющие следующим трем требованиям:
• при различных ферментативных обработках должны сохраняться как антигены, так и нуклеиновые кислоты;
• при иммунодетекции не должно происходить перекрестных реакций;
• субстраты должны окрашиваться в контрастные цвета, чтобы не возникало никакой неоднозначности при интерпретации результатов.

Первое требование является безусловным; иногда даже приходится отказываться от всякой ферментативной обработки и демаскирования, если они сопровождаются разрушением антигенов. В связи с этим сначала проводят полное (вплоть до образования окрашенного продукта) иммуноцитохимическое выявление антигена и только после этого — демаскирование нуклеиновых кислот и гибридизацию in situ.

Из всего сказанного следует, что для иммуноцитохимического анализа необходимо использовать субстрат, устойчивый как к протеолизу, так и к тепловой денатурации. На наш взгляд, наиболее подходящим субстратом является НСТ/БХИФ. В этом случае обработка протеазами и денатурация приводят к разрушению использованных при иммуномечении реактивов и тем самым исключаются перекрестные реакции между системами детекции. используемыми при гибридизации in situ и иммуноцитохимии. С другой стороны, может оказаться, что одна и та же протеолитическая обработка необходима для демаскирования как антигена, так и нуклеиновой кислоты. И вновь здесь не возникает никаких проблем, поскольку иммуноцитохимическую детекцию можно провести до ГИС, и если образовавшийся окрашенный продукт устойчив к денатурации, то ГИС приведет к двойному окрашиванию срезов. И наконец, бывают ситуации, когда необходимая для выявления антигена обработка (например, трипсинизация) недостаточна для демаскирования нуклеиновых кислот. В таком случае оптимальный метод демаскирования подбирается опытным путем. Так, мы обнаружили, что эффективного демаскирования можно достичь повторной (после иммунохимического выявления антигена) протеолитической обработкой с использованием меньших концентраций протеиназы К или солянокислого пепсина. Такой подход с успехом применялся нами при анализе нескольких поверхностных и цитоплазматических антигенов с одновременным выявлением ДНК вируса папилломы человека.

Перекрестные реакции между используемыми для иммунологической детекции реактивами происходит относительно редко, поскольку применяющиеся при первой детекции реактивы в ходе последующих ферментативных обработок и денатурации разрушаются. Тем не менее необходимо убедиться в отсутствии перекрестных реакций с помощью соответствующих контролен.

Контрастная окраска образующихся при работе с различными субстратами продуктов реакции необходима, когда используется несколько меток, особенно при одновременном определении белков и нуклеиновых кислот в одном клеточном ком-партменте, например цитоплазме или ядре. Мы обнаружили, что хороший контраст при обычной световой микроскопии наблюдается тогда, когда продукты реакции имеют красный и синий/черный цвета. Продукты красного цвета в реакции с пероксидазой образуются, если в качестве субстрата используется 3-амино-9-этил-карбазол/пероксид водорода, а в реакции с ЩФ, если используется быстрый красный или новый фуксин. Сине-черный цвет имеют продукты реакции, образующиеся при связывании пероксидазы с диаминобензидином/пероксидом водорода, усилении серебром окрашенных коллоидным золотом антител, связывании ЩФ с НСТ/БХИФ или быстрым голубым ВВ. Значительно больше вариантов окрашивания можно получить, если использовать флуоресцентные метки.

- Читать далее "Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ"

Оглавление темы "Выявление вирусов при гибридизации in situ":
1. Контроли при гибридизации in situ. Виды контролей при гибридизации in situ
2. Высокий фон при гибридизации in situ. Оборудование для гибридизации in situ
3. Реактивы для гибридизации in situ. Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
4. Комбинирование иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Многократная гибридизация in situ
5. Выявление вирусов методом гибридизации in situ. Подготовка предметных стекол для выявления вирусов
6. Препараты приготовленные с помощью центрифугирования. Биоптаты для выявления вирусов
7. Обработка вирусных срезов для гибридизации. Зонды для выявления вирусов
8. Мечение зондов для гибридизации вирусов. ДНК-зонды для выявления вирусов
9. РНК-зонды для выявления вирусов. Олигонуклеотидные зонды для диагностики вирусов
10. ПНР-зонды для выявления вирусов. Получение ДНК-зондов для выявления вируса папилломы человека

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: