Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Гибридные молекулы мишень/зонд при использовании изотопно меченных зондов выявляют радиоавтографическим методом. Для выявления неизотопно меченных зондов применяют те же подходы, что и в иммуноцитохимических исследованиях, но детали соответствующих методов существенно различаются. Выбирая метод детекции, необходимо ответить на два вопроса: а) какой раствор использовать для инкубации? б) на какой системе детекции остановиться? Как показывает наш опыт, оптимальное отношение сигнал/шум достигается при инкубации срезов и клеток в растворах антител, содержащих те же реактивы (детергенты и животные белки), которые использовались для блокирования неспецифического связывания. Кроме того, неспецифическое окрашивание ядер авидином можно существенно уменьшить инкубацией конъюгатов авидина с ферментами в растворе, содержащем обезжиренное сухое молоко.

Рекомендуется также проводить отмывание при высоких рН и концентрации солей. Однако при высокой ионной силе уменьшается стабильность комплекса антиген—антитело, и этот способ можно применять только в системах с одноступенчатой детекцией авидина. Отмывание при высоких рН тоже нельзя считать универсальным подходом. Выбирая систему детекции, в первую очередь надо решить вопрос о том, флуоресцентные или нефлуоресцентные методы будут использоваться. Флуоресцентные системы обладают высокой чувствительностью и большей разрешающей способностью (особенно при исследовании отдельных клеток), но они слишком сложны для повседневной работы в клинической лаборатории или для исследования архивных залитых в парафин препаратов. Кроме того, флуоресцентные микроскопы очень дороги, а большинство флуоресцентных меток даже при их стабилизации с помошью различных ингибиторов выцветают под действием света с определенной длиной волны.

В отличие от этого, применение нефлуоресцентных систем сопряжено с незначительной модификацией используемых в иммуноцитохимии методов. Окрашенные продукты реакции стабильны и их легко анализировать с помощью обычной световой микроскопии, Таким образом, в повседневной практике лучше использовать методы, не требующие применения изотопно или флуоресцентно меченных зондов. Самой простой системой детекции является одноступенчатая с использованием конъюгатов антител или авидина с ферментом-индикатором. Усилить сигнал можно либо наслаиванием антител, либо применением комплексов фермент—антитело, повышающих количество фермента, связывающегося с каждой молекулой-свидетелем. В методах, основанных на использовании авидин-биотинового комплекса (ABC), применяют оба способа усиления сигнала.

Большинство описанных методов легко модифицировать для выявления других молекул-свидетелей, используя соответствующие первые антитела; это позволяет создавать гибкие, обладающие разной чувствительностью системы детекции.

Детекция зондов и монтирование срезов

А. Детекция биотинилированных зондов
Здесь описан метод одноступенчатой детекции с использованием конъюгата авидина с пероксидазой или щелочной фос-фатазой.
Материалы
• Буфер ТСБ или ТБТ
• Конъюгат авидина с щелочной фосфатазой (ЩФ) или пероксидазой хрена (ПХ) (Dako, UK)

гибридизовавшийся зонд

Методика
1. Срезы инкубируют 30 мин при 22 С в разведенном в ТБТ (1:100) конъюгате авидина с ЩФ или ПХ.
2. Отмывают несвязавшийся конъюгат два раза по 5 мин в ТСБ.
3. Инкубируют срезы в субстрате для ЩФ или пероксидазы.
4. Чтобы остановить реакцию, промывают срезы в дистиллированной воде в течение 5 мин.
5. Высушивают срезы на воздухе при 42 °С, окрашивают их и монтируют в глицериновом желе.

Б. Приготовление субстрата
Многие субстраты для рутинных определений можно приобрести в виде соответствующих наборов (например, набор АЕС фирм Dako, UK, или Zymed, USA).
Нитросиний тетразолий (НСТ)/5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (БХИФ) (субстрат для ЩФ)

Материалы
• Буфер для субстрата: 50 мМ трис-НС1, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, РН 9,5
• 1 М левамизол в дистиллированной воде (не обязателен)
• Диметилформамид (ДМФ)
• НСТ и БХИФ

Методика
1. 30 мл буфера для субстрата прогревают при 37 "С.
2. 10 мкг НСТ растворяют в 200 мкл ДМФ и к полученному раствору добавляют 1 мл подогретого буфера для субстрата.
3. Полученную смесь по каплям добавляют к остальному подо гретому буферу для субстрата.
4. 5 мкг БХИФ растворяют в 200 мкл ДМФ и медленно вливают полученный раствор в буфер для субстрата.
5. При необходимости в полученный буфер добавляют левамизол до конечной концентрации 0,1 мМ3'.
6. Разливают порциями по 4 мл и хранят при —20 °С.

3-амино-9-этилкарбазол (АЭК)/пероксид водорода (Н2О2) (субстрат для пероксидазы)
Этот субстрат должен быть свежеприготовленным. Материалы
• 20 мМ ацетатный буфер, рН 5.2
• АЭК и 30% Н202

Методика
1. 2 мг АЭК растворяют в стеклянной пробирке в 1,2 мл диметилсульфоксида.
2. Полученный раствор вливают в 10 мл 20 мМ ацетатного буфера, рН 5,0-5,2.
3. Непосредственно перед использованием к раствору субстрата добавляют 1 мкл 30% (о/о) H2О2. Возможно, полученный раствор придется профильтровать.

В. Глицериновое желе
Материалы
• Желатина
• Глицерин
• Фенол

Методика
1. 10 г желатины растворяют в 60 мл дистилированной воды в водяной бане (37 °С) или на магнитной мешалке с подогревом.
2. К полученному раствору добавляют 70 мл глицерина и 0,25 г фенола.
3. Получившееся желе хранят при комнатной температуре (желе затвердевает) или при 42 °С (желе остается мягким). Необходимо отметить, что при монтировании срезов на этом желе происходит удаление водорастворимых красителей.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: