Время гибридизации. Гибридизационная смесь

Отжиг высокоповторяющихся последовательностей происходит быстро, и время гибридизации может быть небольшим. Так, при высоком титре вируса и выявлении хромосомоспецифичных высокоповторяющихся последовательностей для гибридизации достаточно двух часов. Для низкокопийных последовательностей процесс занимает гораздо больше времени, в некоторых случаях до 40 ч, но обычно гибридизацию проводят в течение ночи. Оптимальное время подбирают опытным путем, используя для каждой комбинации зонд/мишень свои положительные и отрицательные контроли.
В состав гибридизационной смеси входят две группы компонентов: абсолютно необходимые и те, без которых можно обойтись.

К числу необходимых компонентов относятся моновалентные катионы (обычно ионы натрия), декстрансульфат, гибридизационный буфер и меченый зонд. Концентрация моновалентных катионов и формамида определяется жесткостью условий гибридизации, а применение декстрансульфата связано с тем, что за счет молекулярного вытеснения он увеличивает эффективную концентрацию зонда; для достижения максимального эффекта используют декстрансульфат с мол. массой более 8000. Меченый зонд должен иметь подходящий размер и присутствовать в нужной концентрации. Если зонд будет слишком большим, он не сможет проникнуть через клеточный матрикс даже после протеолитической обработки. Мы считаем, что оптимальный размер зондов, полученных методом ник-трансляции, — 200-400 п.н. При меньшей длине повышается уровень фоновой гибридизации вследствие неспецифической абсорбции зонда клеточными структурами. Подбирая концентрацию зонда, необходимо соблюдать баланс между временем и полнотой гибридизации, с одной стороны, и отношением сигнал/шум, с другой. При этом необходимо учитывать, что гибридизация зонда с последовательностью-мишенью — это реакция второго порядка, но в случае гибридизации с ДНК-мишенями на нее накладывается отжиг последовательности-мишени самой на себя. В результате при повышении концентрации зонда до 1—2 нг/мкл происходит насыщение как при анализе мРНК, так и при анализе ДНК. В то же время неспецифическое связывание зонда происходит без насыщения, и, таким образом, оптимальной является концентрация зонда, при которой наблюдается насыщение специфической гибридизации. Обычно мы работаем при концентрации 2 нг/мкл; при меньших концентрациях существенно снижается чувствительность метода.

Для уменьшения неспецифической гибридизации в гибридизационную смесь иногда добавляют избыточное по отношению к зонду количество немеченой ДНК человека (зонды вирусного происхождения) или ДНК спермы лосося (если в качестве зонда используется геномная ДНК человека), а также другие вещества, например фиколл и поливинилпирролидон. Их применение определяется условиями конкретного эксперимента, которые мы обсудим в соответствующих разделах.

Денатурация и гибридизация

Материалы
• Формамид
• Ионообменная смола Bio-Rad AG501-X8, 20-50 меш
• Декстрансульфат
• 20 х SSC: 3 М NaCI, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Меченый зонд
• Буфер ТЭ
• Чашки Терасаки (Gibco/Nunc, UK)

время гибридизации

Методика
А. Приготовление гибридизационного буфера (ГБ)
1. Деионизуют формамид, перемешивая в течение 45 мин 50 мл формамида с 5 г ионообменной смолы. Затем дважды профильтровывают формамид через бумажный фильтр ватман N° 1 и хранят его порциями при —20 °С.
2. Смешивают:
• деионизованный формамид 5 мл
• 50% (в/о) декстрансульфат 1 мл
• 20 х SSC 1 мл
3. Доводят рН буфера до 7,0 с помощью 5 М НС1 и хранят его при 4 С.

Б. Денатурация и гибридизация
1. На каждые 7 мкл ГБ добавляют 10—20 нг меченого зонда.
2. К получившейся гибридизационной смеси (ГС) можно добавить те компоненты, которые не являются необходимыми для гибризидации).
3. К полученной ГС добавляют ТЭ, доведя ее объем до 10 мкл на каждые 7 мкл исходного ГБ,
4. На каждый срез капают от 5 до 20 мкл полученной смеси.
5. Покрывают срез покровным стеклом.
6. Помешают стекла со срезами в чашки Терасаки (по 2 среза в чашку).
7. Проводят денатурацию либо в вентилируемом сушильном шкафу при 95 °С в течение 15 мин, либо в микроволновой печи. Время денатурации в последнем случае подбирают для каждой печи опытным путем.
8. Проводят гибридизацию в суховоздушном термостате при 42 С в течение 2—16 ч.

- Читать далее "Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: