Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации

Образец отмывают после гибридизации для того, чтобы:
• удалить негибридизовавшийся зонд;
• блокировать неспецифическое связывание антител и неспецифическую ферментативную активность;
• ужесточить условия гибридизации.

Для решения первой задачи срезы промывают такими растворами, в которых образовавшиеся гибриды между зондом и последовательностью-мишенью остаются стабильными. Обычно это SSC-буфер в высокой концентрации с нейтральным рН. Неспецифическое связывание компонентов, входящих в систему детекции, блокируют разными способами, например с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА) или антисывороток животных. Для облегчения диффузии антител в препарате последний инкубируют в растворе, содержащем небольшое количество детергентов.

Таким образом, принципы блокирования неспецифического связывания аналогичны используемым в иммуноцитохимии. Для ингибирования эндогенных ферментов применяют разные методы. Чаще всего проводят ферментативную обработку и тепловую денатурацию, но иногда при анализе архивных препаратов с использованием систем детекции на основе щелочной фосфатазы/пероксидазы применяют другие методы. Если возникают проблемы, связанные с наличием в тканях эндогенной щелочной фосфатазы, обычно вводят в ферментный субстрат левамизол.

При анализе тканей с большим содержанием эритроцитов, в том случае, если в системе детекции используется пероксидаза, может наблюдаться повышенный фон.Последний метод особенно удобен при анализе мазков и биоптатов шейки матки.

отмывание после гибридизации

Жесткость условий гибридизации уже частично задается условиями самой реакции. Однако она определяется не только величиной Тт, но и диффузией зонда к последовательности-мишени и возможностью начала гибридизации. Эти факторы несущественны для отмывания после гибридизации, и жесткость на этом этапе зависит только от Тт. Условия легко ужесточить, проводя отмывание в растворах, где стабильность гибридов зонд/мишень уменьшается до уровня, когда сохраняются только гибриды с нужной степенью гомологии. Для этого уменьшают концентрацию моновалентных катионов (ионов натрия), повышают концентрацию формамида и/или температуру отмывания.

Необходимо отметить, что жесткость при отмывании возрастает только тогда, когда использующиеся для ее проведения растворы дестабилизируют гибриды зонд—мишень сильнее самой гибридизационной смеси. По аналогии с гибридизацией в растворе величину Тm можно определить при ступенчатом увеличении жесткости условий отмывания до полного исчезновения гибридизационного сигнала. Ясно, что это будет каждый раз какая-то своя Тm, так что при любом сочетании условий гибридизации и отмывании ее нужно определять опытным путем, используя хорошо характеризованные последовательности-мишени.

Отмывание препаратов после гибридизации

Материалы
• 4 х SSC
• Формамид
• Трис-солевой буфер (ТСБ): 50 мМ трис-HCl, рН 7,2, 100 мМ NaCI
• БСА: фракция V, химически чистый
• Тритон Х-100

Методика
1. Промывают срезы два раза по 5 мин при комнатной температуре в 4 х SSC.
2. Промывают срезы в течение 30 мин при определяемой условиями эксперимента температуре в формамидно-солевой смеси (например, в 50% формамиде/0,1 х SSC), обеспечивающей жесткие условия.
3. Промывают срезы 5 мин при комнатной температуре в 4 х SSC,
4. Инкубируют срезы 30 мин в ТСБ, содержащем 5% (в/о) БСА и 0,05% (о/о) тритон Х-100. В зависимости от характера эксперимента можно использовать и другие антисыворотки.

- Читать далее "Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: