Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот

Многие экспериментаторы после демаскирования нуклеиновых кислот перед гибридизацией инкубируют срезы в не содержащей зонда гибридизационной смеси, по аналогии с тем, как это делается при гибридизации на фильтрах. Наш опыт и опыт других авторов говорит, что этот этап не является обязательным при выявлении вирусной ДНК, геномной ДНК и мРНК с помощью неизотопных методов. Однако при работе с радиоактивно меченными зондами предгибридизация бывает необходима.

Некоторые варианты гибридизции in situ включают дополнительные процедуры, например ацетилирование и обработку кислотой. Однако они не оказывают существенного влияния на результаты, и подробное описание отдельных модификаций метода ГИС дано в тех главах, где рассматривается использование ГИС для решения конкретных задач.

Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот

Материалы
• Протеиназа К (Boehringer Mannheim) или пепсин-HCl (Sigma, UK)
• ФСБ
• Чашки Терасаки (Gibco, UK)

предгибридизация срезов

Методика
А. Депарафинирование
1. Из парафиновых блоков делают срезы толщиной 5мкм и помещают их на подготовленные по описанному в протоколе методу предметные стекла.
2. Прогревают срезы в течение ночи при 60 С или в течение 45 мин при 75 °С. Далее срезы можно хранить при комнатной температуре.
3. Чтобы расплавить парафин, срезы прогревают в течение 15 мин при 75°С.
4. Промывают срезы в ксилоле при комнатной температуре два раза по 5 мин.
5. Удаляют ксилол, промывая срезы в 99% (технически чистом) этаноле (три раза по 5 мин при комнатной температуре)".
6. Промывают срезы в дистиллированной воде. Если не предполагается использовать срезы немедленно, то их высушивают на воздухе2'.

Б. Демаскирование
Для демаскирования нуклеиновых кислот используют или протеиназу К, или пепсин-HCl.

Протеиназа К

1. Растворяют лиофилизованную протеиназу К в ФСБ до концентрации 500 мкг/мл (парафиновые срезы) или 1 мкг/мл (замороженные срезы, подготовленные, как это описано в протоколе 4.2).
2. Заливают приготовленным раствором срезы, помешенные в чашки Терасаки, и помещают эти чашки на 15 мин в предварительно нагретую до 37 С водяную баню.
3. Промывают срезы в дистиллированной воде и высушивают их на воздухе при 75 °С.

Пепсин-НСl

1. Нагревают до 37 °С 96 мл дистиллированной воды.
2. Растворяют в этой воде 100 мг пепсина.
3. К полученному раствору при осторожном перемешивании добавляют 4 мл 5 М HCI.
4. В этом растворе в химическом стакане инкубируют срезы при 37 "С в течение 15 мин.
5. Промывают срезы в дистиллированной воде и высушивают их на воздухе при 75 °С.

- Читать далее "Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: