Многие экспериментаторы после демаскирования нуклеиновых кислот перед гибридизацией инкубируют срезы в не содержащей зонда гибридизационной смеси, по аналогии с тем, как это делается при гибридизации на фильтрах. Наш опыт и опыт других авторов говорит, что этот этап не является обязательным при выявлении вирусной ДНК, геномной ДНК и мРНК с помощью неизотопных методов. Однако при работе с радиоактивно меченными зондами предгибридизация бывает необходима.

Некоторые варианты гибридизции in situ включают дополнительные процедуры, например ацетилирование и обработку кислотой. Однако они не оказывают существенного влияния на результаты, и подробное описание отдельных модификаций метода ГИС дано в тех главах, где рассматривается использование ГИС для решения конкретных задач.

Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот

Материалы
• Протеиназа К (Boehringer Mannheim) или пепсин-HCl (Sigma, UK)
• ФСБ
• Чашки Терасаки (Gibco, UK)

Методика
А. Депарафинирование
1. Из парафиновых блоков делают срезы толщиной 5мкм и помещают их на подготовленные по описанному в протоколе методу предметные стекла.
2. Прогревают срезы в течение ночи при 60 С или в течение 45 мин при 75 °С. Далее срезы можно хранить при комнатной температуре.
3. Чтобы расплавить парафин, срезы прогревают в течение 15 мин при 75°С.
4. Промывают срезы в ксилоле при комнатной температуре два раза по 5 мин.
5. Удаляют ксилол, промывая срезы в 99% (технически чистом) этаноле (три раза по 5 мин при комнатной температуре)".
6. Промывают срезы в дистиллированной воде. Если не предполагается использовать срезы немедленно, то их высушивают на воздухе2'.

Б. Демаскирование
Для демаскирования нуклеиновых кислот используют или протеиназу К, или пепсин-HCl.

Протеиназа К

1. Растворяют лиофилизованную протеиназу К в ФСБ до концентрации 500 мкг/мл (парафиновые срезы) или 1 мкг/мл (замороженные срезы, подготовленные, как это описано в протоколе 4.2).
2. Заливают приготовленным раствором срезы, помешенные в чашки Терасаки, и помещают эти чашки на 15 мин в предварительно нагретую до 37 С водяную баню.
3. Промывают срезы в дистиллированной воде и высушивают их на воздухе при 75 °С.

Пепсин-НСl

1. Нагревают до 37 °С 96 мл дистиллированной воды.
2. Растворяют в этой воде 100 мг пепсина.
3. К полученному раствору при осторожном перемешивании добавляют 4 мл 5 М HCI.
4. В этом растворе в химическом стакане инкубируют срезы при 37 "С в течение 15 мин.
5. Промывают срезы в дистиллированной воде и высушивают их на воздухе при 75 °С.

- Читать далее "Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации"