С помощью гибридизации in situ можно исследовать срезы толщиной 3—10 мкм. Поскольку в ходе предварительной обработки срезов проводят ограниченный протеолиз, во избежание растрескивания срезов во время гибридизации in situ стекла обрабатывают различными адгезивными веществами. Как показывает наш опыт, наиболее эффективна обработка аминопропилтриэтоксисиланом; это дает возможность использовать высокие концентрации ферментов без потери клеточного материала. Обработка покровных стекол органосиланами позволяет оптимизировать условия демаскирования срезов с сохранением морфологии клеток и тканей. Приготовленные таким образом стекла можно применять при работе с культурами клеток, срезами замороженных или залитых в парафин тканей.

Обработка предметных стекол

Материалы
• Декон 90
• Аминопропилтриэтоксисилан (Sigma, UK)
• Ацетон

Методика
1. Предметные стекла помещают в держатель и промывают в предварительно нагретом до 60 С 2% (о/о) растворе декона 90 в дистиллированной воде.
2. Тщательно промывают стекла в дистиллированной воде и ацетоне и высушивают их на воздухе.
3. Помешают стекла на 30 мин в 2% {о/о) аминопропилтриэтоксисилан в ацетоне.
4. Ополаскивают стекла в ацетоне, промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе при 37 °С.
5. Приготовленные таким образом стекла можно хранить при 22 С сколь угодно долго, но адгезивные свойства у свежеприготовленных стекол (в первые 24 ч после обработки) значительно лучше.
Раствор можно использовать несколько раз; 600 мл достаточно для обработки 200 предметных стекол.

Предварительная обработка срезов включает:
• депарафинирование срезов тканей, залитых в парафин;
• демаскирование нуклеиновой кислоты-мишени;
• обработку РНКазой или ДНКазой;
• предгибридизацию срезов.

Депарафинирование. Из залитых в парафин архивных образное необходимо удалить парафин. Для этого можно использовать обычные приемы, применяющиеся в гистологии, но наш опыт показывает, что нагревание срезов до их помещения в ксилол улучшает гибридизацию.

Демаскирование нуклеиновых кислот. В клетках и тканях нуклеиновая кислота-мишень находится в контакте с другими клеточными компонентами и при фиксации альдегидами оказывается сшитой с другими нуклеиновыми кислотами и связанными с ними белками. Перед гибридизацией эти пришитые компоненты необходимо удалить, чтобы облегчить доступ зонда к нуклеиновой кислоте-мишени. При этом нужно стараться сохранить достаточное количество клеточного материала, с тем чтобы не нарушить морфологию тканей и клеток, избежать разрушения среза и потери последовательности-мишени. В случае тканей, фиксированных только в смеси спирт/кислота, демаскирование не требуется. Для демаскирования проводят ограниченный протеолиз, подбирая в каждом случае условия опытным путем. Наиболее широко используются два фермента: протеиназа К и пепсин-HCl, но применяют и другие ферменты, например проназу, Первый из этих ферментов особенно часто используют для демаскирования вирусной ДНК, заключенной в белковую оболочку, а второй менее эффективен при анализе вирусных ДНК, но более удобен при проведении анализа РНК и геномной ДНК. Протеолитическую обработку разных тканей проводят при разной концентрации фермента.

Так, в случае замороженных срезов концентрация протеиназы К составляет 1—2 мкг/мл, а при работе с залитыми в парафин срезами используют тот же фермент в концентрации 500 мкг/мл. От качества демаскирования нуклеиновых кислот зависят воспроизводимость результатов ГИС и чувствительность метода, поэтому, подобрав определенный фермент, нужно с ним и работать. Максимальная концентрация фермента ограничивается необходимостью сохранения морфологии клеток и тканей, а также целостности среза. Для оптимизации условий гибридизации нужно обработать предметные стекла органосиланом, подобрать фермент и его концентрацию.

Обработка ДНКазой или РНКазой. Нуклеазная обработка срезов перед гибридизацией решает две задачи. Во-первых, удаление нуклеиновой кислоты-мишени обеспечивает отрицательный контроль. Во-вторых, при обработке РНКазой повышается специфичность гибридизации ДНК—ДНК, а при обработке ДНКазой — специфичность анализа РНК. Это особенно важно при изучении экспрессии вирусных генов, когда вирусная ДНК в клетке представлена большим числом копий.

- Читать далее "Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот"