Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот

С помощью гибридизации in situ можно исследовать срезы толщиной 3—10 мкм. Поскольку в ходе предварительной обработки срезов проводят ограниченный протеолиз, во избежание растрескивания срезов во время гибридизации in situ стекла обрабатывают различными адгезивными веществами. Как показывает наш опыт, наиболее эффективна обработка аминопропилтриэтоксисиланом; это дает возможность использовать высокие концентрации ферментов без потери клеточного материала. Обработка покровных стекол органосиланами позволяет оптимизировать условия демаскирования срезов с сохранением морфологии клеток и тканей. Приготовленные таким образом стекла можно применять при работе с культурами клеток, срезами замороженных или залитых в парафин тканей.

Обработка предметных стекол

Материалы
• Декон 90
• Аминопропилтриэтоксисилан (Sigma, UK)
• Ацетон

Методика
1. Предметные стекла помещают в держатель и промывают в предварительно нагретом до 60 С 2% (о/о) растворе декона 90 в дистиллированной воде.
2. Тщательно промывают стекла в дистиллированной воде и ацетоне и высушивают их на воздухе.
3. Помешают стекла на 30 мин в 2% {о/о) аминопропилтриэтоксисилан в ацетоне.
4. Ополаскивают стекла в ацетоне, промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе при 37 °С.
5. Приготовленные таким образом стекла можно хранить при 22 С сколь угодно долго, но адгезивные свойства у свежеприготовленных стекол (в первые 24 ч после обработки) значительно лучше.
Раствор можно использовать несколько раз; 600 мл достаточно для обработки 200 предметных стекол.

гибридизация in situ

Предварительная обработка срезов включает:
• депарафинирование срезов тканей, залитых в парафин;
• демаскирование нуклеиновой кислоты-мишени;
• обработку РНКазой или ДНКазой;
• предгибридизацию срезов.

Депарафинирование. Из залитых в парафин архивных образное необходимо удалить парафин. Для этого можно использовать обычные приемы, применяющиеся в гистологии, но наш опыт показывает, что нагревание срезов до их помещения в ксилол улучшает гибридизацию.

Демаскирование нуклеиновых кислот. В клетках и тканях нуклеиновая кислота-мишень находится в контакте с другими клеточными компонентами и при фиксации альдегидами оказывается сшитой с другими нуклеиновыми кислотами и связанными с ними белками. Перед гибридизацией эти пришитые компоненты необходимо удалить, чтобы облегчить доступ зонда к нуклеиновой кислоте-мишени. При этом нужно стараться сохранить достаточное количество клеточного материала, с тем чтобы не нарушить морфологию тканей и клеток, избежать разрушения среза и потери последовательности-мишени. В случае тканей, фиксированных только в смеси спирт/кислота, демаскирование не требуется. Для демаскирования проводят ограниченный протеолиз, подбирая в каждом случае условия опытным путем. Наиболее широко используются два фермента: протеиназа К и пепсин-HCl, но применяют и другие ферменты, например проназу, Первый из этих ферментов особенно часто используют для демаскирования вирусной ДНК, заключенной в белковую оболочку, а второй менее эффективен при анализе вирусных ДНК, но более удобен при проведении анализа РНК и геномной ДНК. Протеолитическую обработку разных тканей проводят при разной концентрации фермента.

Так, в случае замороженных срезов концентрация протеиназы К составляет 1—2 мкг/мл, а при работе с залитыми в парафин срезами используют тот же фермент в концентрации 500 мкг/мл. От качества демаскирования нуклеиновых кислот зависят воспроизводимость результатов ГИС и чувствительность метода, поэтому, подобрав определенный фермент, нужно с ним и работать. Максимальная концентрация фермента ограничивается необходимостью сохранения морфологии клеток и тканей, а также целостности среза. Для оптимизации условий гибридизации нужно обработать предметные стекла органосиланом, подобрать фермент и его концентрацию.

Обработка ДНКазой или РНКазой. Нуклеазная обработка срезов перед гибридизацией решает две задачи. Во-первых, удаление нуклеиновой кислоты-мишени обеспечивает отрицательный контроль. Во-вторых, при обработке РНКазой повышается специфичность гибридизации ДНК—ДНК, а при обработке ДНКазой — специфичность анализа РНК. Это особенно важно при изучении экспрессии вирусных генов, когда вирусная ДНК в клетке представлена большим числом копий.

- Читать далее "Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: