Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды

Одноцепочечную ДНК (оцДНК) можно получить из последовательностей, клонированных в нитчатых фагах типа М13 или в фагмидах, активированных фаговой суперинфекцией, но при этом иногда возникают сложности с клонированием только одной из двух комплементарных цепей. Специфическое мечение одной цепи ДНК осуществляют с помощью рассеянной затравки или уникальных праймеров; при этом меченый зонд синтезируется в тех же количествах, что и немеченая ДНК-матрица, и перед гибридизацией нужно провести денатурацию зонда. Одноцепочечные ДНК-зонды применяются в опытах по гибридизации in situ весьма ограниченно.

В последние годы РНК-зонды (рибо-зонды) стали широко использоваться для выявления мРНК как при изотопной, так и при неизотопной ГИС. Это связано с более высокой стабильностью гибридов РНК—РНК по сравнению с гибридами РНК—ДНК и доступностью плазмидных векторов и векторов других типов, содержащих промоторы для РНК-полимераз. Мечение РНК-зондов проводят с помощью транскрипции in vitro. Вкратце процесс сводится к следующему. В вектор по обе стороны от последовательности, которую нужно пометить, встраивают промоторы для РНК-полимераз бактериофагов и проводят инкубацию в присутствии меченых рибонуклеотидов. В результате синтезируются меченые РНК-фрагменты разной длины, но не больше заданной величины, такие, что в них отсутствуют последовательности, комплементарные вектору.

Используя векторы, содержащие по разные стороны от сайта клонирования промоторы для разных РНК-полимераз, можно получить отдельно смысловые и антисмысловые зонды. Антисмысловой зонд комплементарен мРНК и гибридизуется с ней, а последовательность смыслового зонда идентична последовательности мРНК, и гибридизации не происходит. Отсутствие гибридизации со смысловым зондом можно считать отрицательным контролем. Возможность пометить рибо-зонды до высокой удельной активности и обработка препаратов РНКазой после гибридизации для расщепления негибридизовавшегося одноцепочечного РНК-зонда позволяет существенно снизить фон.

днк зонды

Олигонуклеотиды широко используются для выявления мРНК, особенно в тех случаях, когда последняя присутствует в больших количествах (например, мРНК легкой цепи иммуноглобулинов в плазматических клетках. Это самые короткие из используемых зондов и обычно их метят путем химического или ферментативного достраивания с одного или обоих концов мечеными нуклеотидами. Олигонуклеотидные зонды не дают столь высокой чувствительности, как зонды, помеченные с помощью ник-трансляции или рассеянной затравки, и для повышения чувствительности используют при гибридизации смесь примерно 20 разных олигонуклеотидов. Теоретически любые олигонуклеотиды в геноме человека длиной более 16 звеньев являются уникальными и, следовательно, обеспечивают более специфичную гибридизацию.

Кроме того, олигонуклеотидные зонды для любой секвенированной нуклеотидной последовательности или для последовательностей, предсказанных исходя из соответствующих последовательностей аминокислот, можно быстро синтезировать с помощью автоматического синтезатора. Такие олигонуклеотиды применяют как по отдельности, так и в разных сочетаниях, но в последнем случае необходимо исследовать специфичность каждого олигонуклеотида, поскольку стабильность образующихся гибридов варьирует. Для мечения олигонуклеотидных зондов не подходит ни один из описанных выше методов, так как олигонуклеотиды нельзя клонировать или получить в двухцепочечной форме. В этом случае молекулы-свидетели включают в олиго-нуклеотид с помощью одного из четырех методов: концевого ферментативного включения, химического мечения, фотомечения, включения меченых нуклеотидов в ходе синтеза.

Зонды, получаемые при помощи ПЦР. Последнее время для получения меченых зондов стали применять ПЦР. Достоинство этого метода состоит в том, что метку можно ввести в зонд непосредственно в ходе ПЦР, без предварительного его клонирования. Кроме того, используя недавно разработанную модификацию ПЦР, так называемую обратную ПЦР, можно получить зонды и для фланкирующих исследуемую область неизвестных последовательностей. Для синтеза и мечения одноцепочечных ДНК можно использовать ассиметричную ПЦР, проводимую при молярном отношении праймеров от 20:1 до 50:1. При этом образуется небольшое количество двухцепочечной меченой ДНК, и для синтеза только одноцепочечной ДНК необходим один праймер и большие количества матрицы. Выход ситезированного зонда при такой реакции намного меньше, чем при обычной ПЦР.

Размер меченого зонда при эффективном неизотопном мечении составляет не более 1 т.п.н., и благодаря однородности образующихся меченых фрагментов они не гибридизуются между собой, как это происходит с ник-транслированными зондами.

- Читать далее "Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: