Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция

После того, как молекула-свидетель выбрана, ее нужно включить в зонд. Существуют разные виды зондов и способы мечения, и окончательный их выбор определяется целями эксперимента.

Двухцепочечные ДНК-зонды используются прежде всего для выявления ДНК, но могут применяться и для гибридизации с РНК. Обычно они представляют собой бактериальные плазмиды со встроенной специфической последовательностью. Для мечения двухцепочечной ДНК используются два метода.

Ник-трансляция. Этот метод чаще всего применяется для выявления ДНК, поскольку соответствующие зонды легко получать и с ними удобно работать. Метод включает внесение в двухцепочечную ДНК случайных разрывов, в результате чего образуются меченые фрагменты разной длины с разным соотношением между векторной ДНК и вставкой. Предполагается, что такие фрагменты при отжиге соединяются друг с другом по перекрывающимся последовательностям, образуя сеть, что приводит к усилению сигнала в месте локализации последовательности-мишени и повышению чувствительности метода. Альтернативный метод состоит в рестрикционном вырезании зонда из плазмиды. Теоретически это предотвращает неспецифическое связывание вектора при гибридизации, но наш опыт показывает, что более высокую чувствительность обеспечивает мечение вектора с встроенным зондом, а не вырезанного зонда. Неспецифическое связывание вектора можно учесть, проведя соответствующий контрольный опыт.

Наборы для ник-трансляции можно приобрести у нескольких фирм (например, Gibco BRL, UK). При работе с ними необходимо строго следовать рекомендациям фирмы-изготовителя. Для удаления невключившихся нуклеотидов мы используем переосаждение этанолом, но с равным успехом можно применять центрифугирование микроколонок.

Материалы:
• ДНК для мечения
• Немеченые нуклеотиды, которые могут поставляться по отдельности (например, фирмой Sigma, UK) или в виде смеси (в наборах для ник-трансляции): для мечения биотином — по 0,2 мМ dCTP, dGTP, dTTP; для мечения дигоксигенином — по 0,2 мМ dCTP, dGTP, dATP
• Меченые нуклеотиды: дигоксигенин-11-dUTP (dig-dUTP, 1мМ; Boehringer Mannheim, Germany) или биотин-7-dATP (bio-dATP, 0,4 мМ; Amersham, UK)
• Смесь dig-dUTP/dTTP (1:2): ее можно приобрести у фирмы Boehringer Mannheim или приготовить самим, смешав 1 мМ растворы dig-dUTP и dTTP в объемном соотношении 1:2
• Ферменты: ДНК-полимераза I (5 ЕД/мкл), ДНКаза I

ник-трансляция

• Гликоген: 20 мг/мл
• 200 мМ ЭДТА, рН 8,0
• 3 М ацетат натрия, рН 6,0
• Абсолютный этанол
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

Методика

1. Смешивают в микроцентрифужной пробирке на 0,5 мл следующие реактивы - биотин и дигоксигенин соответственно:
• Плазмидная ДНК 1 мкг 1 мкг
• Немеченые нуклеотиды 5 мкл 5 мкл
• Смесь dig-dUTP/dTTP — 1 мкл
• Bio-dATP 2,5 мкл —
• ДНКаза 1-5нг 1-5 нг

2. Доводят водой объем реакционной смеси до 49 мкл и инкубируют ее 2 мин при 37 С.
3. Добавляют 1 мкл ДНК полимеразы I (5 ЕД/мкл) и инкубируют 150 мин при 15 С.
4. Добавляют 5 мкл 200 мМ ЭДТА и прогревают реакционную смесь при 75 С 10 мин для остановки реакции.
5. Добавляют 1 мкл гликогена.

6. Добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 6,0, и 2 объема абсолютного этанола.
7. Инкубируют 20 мин в сухом льду или в течение ночи при -20 °С.
8. Центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g 20 мин.
9. Промывают осадок четыре раза 80% этанолом.

10. Осадок высушивают на лиофильной сушке и растворяют в 50 мкл буфера ТЭ.
11. Меченые зонды хранят при —70 С или 4 °С. Если зонды хранятся при -70 °С, их нельзя многократно замораживать и оттаивать.

Синтез, инициируемый рассеянной затравкой. Метод RPDS основан на случайной гибридизации гексамерных олигонуклеотидов с линеаризованной матрицей с последующей ферментативной элонгацией цепи путем присоединения меченых нуклеотидов. Образующийся зонд имеет варьирующую длину, а метку несет не только вставка, но и векторная ДНК. Получаемые таким образом зонды сходны с зондами, сконструированными методом ник-трансляции, но доля фрагментов небольшого размера выше, что может приводить к увеличению фона. Кроме того, перед мечением плазмиду необходимо перевести в линейную форму. Достоинством метода является то, что он позволяет достичь более высокого уровня мечения. По нашему мнению, для обнаружения ДНК лучше использовать зонды, полученные методом ник-трансляции, поскольку они обеспечивают более высокую чувствительность.

- Читать далее "Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: