Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов

Обычно при проведении гибридизации in situ имеют дело или со свежими тканями, или с тканями, фиксированными формалином и залитыми в парафин. Таким образом, прежде чем приступать к анализу, необходимо решить два вопроса: а) какие способы фиксации лучше использовать для свежих или замороженных тканей? б) как получить оптимальные результаты в случае залитой в парафин ткани? Считается, что нуклеиновые кислоты лучше всего сохраняются при фиксации в смеси спирта с кислотой, например в фиксаторе Карнуа.

Однако при этом страдает сама ткань. Как показывает наш опыт, фиксация с помощью альдегидов повышает чувствительность неизотопной ГИС при работе с клеточным материалом и замороженными тканями, особенно если сначала проводится фиксация в смеси спирта с кислотой. Этот подход позволяет максимально сохранить как нуклеиновые кислоты (за счет их преципитации), так и морфологию ткани (благодаря образованию сшивок).
Что касается архивных препаратов, то они уже фиксированы, так что для достижения наилучших результатов соответствующие процедуры необходимо модифицировать.

Фиксация клеток и замороженных срезов

Материалы
• Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ фосфатный буфер, 150мМ NaС1, рН7,2
• Метанол: уксусная кислота (3:1, о/о): в вытяжном шкафу смешивают 25 мл ледяной уксусной кислоты и 75 мл метанола и хранят смесь во льду не более 4 ч. Длительное хранение возможно при -20 С
• Параформальдегид (4%, в/о): растворяют 4 г параформальде-гида (BDH, UK) в 100 мл ФСБ кипячением в конической колбе. Перед использованием охлаждают раствор во льду.
• ФСБ/глицин: 0,2% раствор (в/о) глицина в ФСБ.

гибридизация in situ

Методика
1. Предметные стекла, на которые нанесены свежие клетки или замороженные срезы, на 10 мин помещают в смесь метанол : уксусная кислота (3:1). Можно также фиксировать клетки в суспензии до их нанесения на предметное стекло.
2. Переносят предметные стекла из смеси метанол : уксусная кислота в свежеприготовленный 4% раствор параформальдегида и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
3. Для модификации всех свободных альдегидных групп помешают стекла на 5 мин в раствор ФСБ/глицин.
4. Промывают стекла в ФСБ.
Раствор гигроскопичен, но гигроскопичность значительно уменьшается при снижении температуры до -20 °С.

- Читать далее "Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: