Обычно при проведении гибридизации in situ имеют дело или со свежими тканями, или с тканями, фиксированными формалином и залитыми в парафин. Таким образом, прежде чем приступать к анализу, необходимо решить два вопроса: а) какие способы фиксации лучше использовать для свежих или замороженных тканей? б) как получить оптимальные результаты в случае залитой в парафин ткани? Считается, что нуклеиновые кислоты лучше всего сохраняются при фиксации в смеси спирта с кислотой, например в фиксаторе Карнуа.

Однако при этом страдает сама ткань. Как показывает наш опыт, фиксация с помощью альдегидов повышает чувствительность неизотопной ГИС при работе с клеточным материалом и замороженными тканями, особенно если сначала проводится фиксация в смеси спирта с кислотой. Этот подход позволяет максимально сохранить как нуклеиновые кислоты (за счет их преципитации), так и морфологию ткани (благодаря образованию сшивок).
Что касается архивных препаратов, то они уже фиксированы, так что для достижения наилучших результатов соответствующие процедуры необходимо модифицировать.

Фиксация клеток и замороженных срезов

Материалы
• Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ фосфатный буфер, 150мМ NaС1, рН7,2
• Метанол: уксусная кислота (3:1, о/о): в вытяжном шкафу смешивают 25 мл ледяной уксусной кислоты и 75 мл метанола и хранят смесь во льду не более 4 ч. Длительное хранение возможно при -20 С
• Параформальдегид (4%, в/о): растворяют 4 г параформальде-гида (BDH, UK) в 100 мл ФСБ кипячением в конической колбе. Перед использованием охлаждают раствор во льду.
• ФСБ/глицин: 0,2% раствор (в/о) глицина в ФСБ.

Методика
1. Предметные стекла, на которые нанесены свежие клетки или замороженные срезы, на 10 мин помещают в смесь метанол : уксусная кислота (3:1). Можно также фиксировать клетки в суспензии до их нанесения на предметное стекло.
2. Переносят предметные стекла из смеси метанол : уксусная кислота в свежеприготовленный 4% раствор параформальдегида и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
3. Для модификации всех свободных альдегидных групп помешают стекла на 5 мин в раствор ФСБ/глицин.
4. Промывают стекла в ФСБ.
Раствор гигроскопичен, но гигроскопичность значительно уменьшается при снижении температуры до -20 °С.

- Читать далее "Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот"