Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ

При выборе молекулы-свидетеля необходимо учитывать следующие факторы:
• безопасность;
• чувствительность;
• характер зонда;
• характер нуклеиновой кислоты-мишени;
• доступность подходящей системы детекции.
Рассмотрим все эти факторы по порядку.

Безопасность. При работе с изотопно меченными зондами необходимо создать условия для безопасного захоронения использованных радиоактивных материалов. Персонал должен быть специально обучен методам работы с изотопами. Следует иметь в виду, что для получения радиоавтографов 3Н-меченных зондов необходимо от нескольких суток до нескольких недель, тогда как детекция в случае неизотопных молекул-свидетелей занимает всего 2-5 ч. 35S-зонды более безопасны и требуют меньше времени для радиоавтографии, но все проблемы, связанные с захоронением радиоактивных материалов и обучением персонала, остаются. Тем не менее в некоторых случаях все-таки лучше использовать изотопные методы. Применение неизотопно меченных зондов, детектируемых гистохимическими методами, снимает вопрос о радиоактивном загрязнении, и если исходить только из соображений безопасности, то неизотопные молекулы-свидетели более удобны для повседневной работы. В качестве неизотопной метки используются различные соединения, но не все они одинаково безопасны. Как показывает наш опыт, при рутинных определениях наиболее чувствительными и безопасными являются зонды, меченные биотином и дигоксигенином.

гибридизация in situ

Чувствительность. Считается, что изотопно меченные зонды обеспечивают большую чувствительность, чем неизотопные, однако в последнее время разработаны методы, позволяющие выявлять уникальные гены как на метафазных хромосомах, так и в интерфазном ядре примерно с одинаковой чувствительностью с помощью зондов обоих типов. Кроме того, метод неизотопной гибридизации in situ (НГИС) обладает более высоким разрешением при меньшем фоне. Таким образом, при рутинных определениях он оказывается предпочтительнее, особенно при выявлении ДНК. Первой неизотопной молекулой-свидетелем был биотин (витамин Н), обладающий высоким сродством к природному белку авидину. Поскольку авидин является четырехвалентным белком, он способен связывать как минимум в два раза больше молекул биотина, чем антитела к биотину и, таким образом, аффинный метод выявления биотина более чувствителен, чем иммуноцитохимический. Есть, правда, одно осложняющее обстоятельство: биотин входит в состав многих тканей (особенно высоко его содержание в печени), и использование биотинилированных зондов сопряжено с повышением фона, что затрудняет интерпретацию результатов гибридизации. По этой причине все чаще применяют другие молекулы-свидетели, такие как дигоксигенин, а чувствительность повышают другими способами, например совершенствуя систему детекции.

Характер зонда. Не все молекулы-свидетели удается включать в зонды любым из имеющихся методов. Для мечения дигоксигенином и биотином подходит большое число методов, в частности в случае биотина возможно фотомечение. Что же касается изотопно меченных зондов, то спектр способов мечения здесь более ограничен.

Характер нуклеиновой кислоты-мишени

Для выявления ДНК методом ГИС обычно можно использовать неизотопно меченные зонды. Обнаружение мРНК — задача более сложная, и в настоящее время для этой цели чаще применяют изотопную ГИС.

Доступность подходящей системы детекции

Для детекции неизотопно меченных зондов используются гистохимические методы. Самый простой способ основан на мечении зонда флуорохромом или соответствующим ферментом. Однако такой метод малочувствителен, недостаточно гибок и используется сравнительно редко. Повысить его чувствительность можно, используя для мечения и детекции гаптены и антитела к ним. При этом важно, что реактивы для иммунного и аффинного мечения легкодоступны и сравнительно дешевы. В таблице приведены данные о методах детекции самых распространенных молекул-свидетелей. В случае биотина используется и ряд других методов; разработаны альтернативные методы для детекции дигоксигенина.

- Читать далее "Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция"

Оглавление темы "Гибридизация in situ":
1. Принципы гибридизации in situ. Безопасность гибридизации in situ
2. Двухцепочечные ДНК-зонды. Ник-трансляция
3. Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды
4. Фиксация препаратов при гибридизации in situ. Фиксация клеток и замороженных срезов
5. Обработка предметных стекол при гибридизации in situ. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Предгибридизация срезов. Депарафинирование срезов и демаскирование нуклеиновых кислот
7. Денатурация при гибридизации in situ. Жесткость условий гибридизации
8. Время гибридизации. Гибридизационная смесь
9. Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации
10. Детекция гибридизовавшегося зонда. Методы выявления гибридизовавшегося зонда

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: