Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки

В основе метода рассеянной затравки, как и метода ник-трансляции, лежит синтез новой, комплементарной матрице цепи с помощью ДНК-полимеразы при наличии свободной 3'-гидроксильной группы. Свободную 3-гидроксильную группу «поставляет» короткий олигонуклеотидныи праймер, отожженный с матрицей. Если праймеры гетерогенны по своей нуклеотидной последовательности, то они будут гибридизоваться с разными участками матрицы, так что все ее нуклеотиды будут копироваться при образовании комплементарных фрагментов с равной вероятностью. В качестве праймеров получения меченых копий как ДНК, так и РНК используются гексануклеотиды со случайной последовательностью, полученные либо при расщеплении ДНК тимуса теленка ДНКазой I (Pharmacia, Boehringer Mannheim), либо синтетическим путем (International Biotechnologies).

Тип используемой ДНК-зависимой полимеразы определяется природой матрицы, но в любом случае во избежание деградации праймера полимераза не должна обладать 5'-»3-экзонуклеазной активностью.

Используемую в качестве матрицы одноцепочечную ДНК можно получить либо клонированием в одноцепочечных бактериофагах (типа М13), либо (к этому способу прибегают чаще) с помощью тепловой денатурации двухцепочечных молекул. При этом лучше использовать линейные молекулы ДНК, поскольку кольцевые ДНК быстро ренатури-руют. Метод рассеянной затравки пригоден и в том случае, когда имеют дело с недостаточно чистыми препаратами ДНК. Например, можно использовать фрагменты ДНК, выделенные с помошью электрофореза в агарозном геле. Этот метод часто применяется для отделения клонированных вставок от векторных последовательностей, способных к перекрестной гибридизации с ДНК мишени. При этом плазмиды, полученные описанными выше методами, рестриктируют соответствующими ферментами, фракционируют в агарозном геле и очищают клонированные фрагменты ДНК. Кроме того, Файнберг и Фогельштейн продемонстрировали возможность использования фрагментов ДНК, полученных после разделения в агарозном геле с низкой температурой плавления без предварительной очистки от агарозы.

Получение меченых зондов методом рассеянной затравки

А. Радиоактивное мечение
Материалы
• 10 х буфер для мечения: 500 мМ трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ MgCh, 1 мМ ДТТ, 2 мг/мл БСА
• Гексануклеотиды: 62,5 ОД260/мл
• 10 х dNTP: по 200 мкМ каждого из трифосфатов (dATP, dGTP, dTTP) в ТЭ, РН 8,0
• ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА
• dCTP (удельная радиоактивность > 3000 Ки/ммоль; 110 ТБк/ммоль; 10 мкКи/мкл)
• ДНК-полимераза 1 (фрагмент Кленова): 2 ЕД/мкл
• Стоп-буфер: 300 мМ ЭДТА, рН 8,0

двухцепочечная днк

Методика
1. Растворяют ДН К в воде или ТЭ. Двухцепочечную ДНК денатурируют прогреванием в течение 5 мин при 95—100 С и быстро охлаждают во льду.
2. В находящуюся во льду микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы:
• Денатурированная ДНК 25-250 нг
• l0xdNTP 2мкл
• 10 х буфер для мечения 2 мкл
• dCTP 5 мкл (50 мкКи; 2 МБк)
• Вода до конечного объема 20 мкл
• Фрагмент Кленова 1 мкл (2 ЕД)
Аккуратно перемешивают медленным пипетированием, собирают содержимое пробирки на дне центрифугированием на микроцентрифуге в течение 2 с.

3. Инкубируют пробирку при температуре 20-37 °С в течение 2-16 ч.
4. Останавливают реакцию, добавив 2 мкл стоп-буфера; невключившиеся нуклеотиды удаляют переосаждением этанолом или хроматографией на сефадексе.
5. Перед гибридизацией зонд денатурируют, прогревая его раствор в течение 5 мин при 95—100 °С, быстро переносят в лед и выдерживают в течение 5 мин,

Б. Нерадиоактивное мечение Материалы
То же, что и выше, со следующими изменениями:

Для биотина:
• 10 х bio-dNTP: по 1 мМ каждого из трифосфатов (dATP, dGTP, dCTP) и 0,65 мМ dTTP/0,35 мМ bio-7-dUTP при рН 6,5

Для дигоксигенина:
• 10 х dig-dNTP: по 1 мМ каждого из трифосфатов (dATP, dGTP, dCTP) и 0,65 мМ dTTP/0,35 мМ dig-11-dUTP при рН 6

Методика
1. В находящуюся во льду микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы:
• Свежеденатурированная ДНК 10нг—3 мкг
• 10 х буфер для мечения 2 мкл
• 10 х dig-dNTP или 10 х bio-dNTP 2 мкл
• Вода до конечного объема 20 мкл
• Фрагмент Кленова 1 мкл (2 ЕД)
Аккуратно перемешивают содержимое пробирки медленным пипетированием и собирают его на дне быстрым (2 с) центрифугированием на микроцентрифуге.
2. Проводят те же операции, что и для получения радиоактивно меченных зондов, начиная с п. 3.

- Читать далее "Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР"

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: