Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом

Для очистки от невключившихся нуклеотидов используют два метода.
А. Переосаждение этанолом
Материалы
• 200 мМ ЭДТА, рН 8,0
• 2,5 М ацетат натрия, рН 5,0
• Носитель (ДНК, РНК или гликоген в концентрации 10 мг/мл)
• Холодный этанол
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

Методика
Все описанное ниже относится к реакции мечения, проводимой в объеме 50 мкл. Если реакция проводится в других условиях, то необходимо пропорционально увеличить или уменьшить объем используемых реактивов.
1. К 50 мкл смеси, в которой проводилось мечение, добавляют:
• 0,2 М ЭДТА, рН 8,0 5 мкл
• 2,5 М ацетат натрия, рН 5,0 5 мкл
• Носитель (20 мкг) 2 мкл
• Холодный этанол 200 мкл

нуклеотиды

Полученную смесь перемешивают и охлаждают в сухом льду до -70 °С или оставляют на ночь при -20 С.
2. Собирают нуклеиновые кислоты центрифугированием в микроцентрифуге при 12 000 g в течение 15 мин и осторожно отбирают супернатант (если он радиоактивен, то для захоронения его собирают в пустую пробирку или колбу).
3. Промывают осадок холодным абсолютным или 70% этанолом, повторяют центрифугирование при описанных выше условиях, отбирают супернатант и полученный осадок подсушивают на воздухе.
4. Для последующего использования в качестве зонда растворяют осадок меченой ДНК в нужном объеме ТЭ.

Центрифугирование на колонках с сефадексом

Материалы
• Одноразовый шприц на 1 мл
• Сефадекс G-50—G-300, уравновешенный буфером для промывания колонки
• Носитель (ДНК, РНК или гликоген в концентрации 10 мг/мл)
• Буфер для промывания колонки: 10 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0,1 % ДСН, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5

Методика
1. На дно одноразового шприца на 1 мл кладут небольшой кусочек ваты.
2. Осторожно, не внося пузырьков воздуха, заполняют шприц сефадексом G-50-G-300.
3. Помещают шприц в центрифужную пробирку на 15 мл, наслаивают 5 мкл носителя и пропускают буфер для промывания (4 раза по 250 мкл).
4. Центрифугируют шприц в пробирке при 1600 g 4 мин и удаляют элюат со дна пробирки.
5. На дно центрифужной пробирки помещают пробирку на 1 мл с завинчивающейся крышкой.
6. Наносят на колонку меченую ДНК и центрифугируют ее 4 мин при 1600 g.
7. Вынимают пробирку на 1 мл, в которой содержится элюиро-ванный зонд; невключившиеся нуклеотиды после центрифугирования остаются в шприце.

- Читать далее "Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения"

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: