Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения

Ник-трансляция осуществляется при участии двух ферментов: панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНКазы I) и ДНК-полимеразы I E. coli (ДНК pol I). ДНКаза I вносит случайные разрывы в обе цепи двухцепочечной молекулы, при этом в каждой точке разрыва образуются свободная гидроксильная группа на 3-конце и свободная фосфатная — на 5-конце. Далее с 5-стороны от точки разрыва происходит последовательное отщепление нуклеотидов за счет 5'->3-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I и одновременно за счет 5'->3 -полимеразной активности этого же фермента — присоединение нуклеотидов к свободному 3 -гидроксильному концу. В итоге точка разрыва перемещается вдоль молекулы ДНК. Заменяя обычные нуклеотиды одного или более типов на радиоактивно меченные, можно получить ДНК с высокой удельной радиоактивностью. Условия, в которых проводится ник-трансляция, можно варьировать, получая тем самым меченые фрагменты разного размера и удельной радиоактивности и разное общее количество меченого зонда.

Описанная в протоколе процедура относится к случаю, когда для мечения зонда используются 32P-dNTP, но она пригодна и для таких меток, как 3Н или 3SS, а также для нерадиоактивных молекул-свидетелей биотина и дигоксигенина.
Эффективность включения метки при ник-трансляции должна превышать 60%, при этом удельная радиоактивность зонда обычно составляет 5 - 108 расп./мин на 1 мкг.

Мечение ДНК с помощью ник-трансляции

А. Радиоактивное мечение
Материалы
• 10 х буфер для ник-трансляции (10 х НК-буфер): 500 мМ трис-НС1, рН 7,6, 50 мМ MgCl2,10 мМ 2-меркаптоэтанол
• ТЭ-буфер: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА
• Стоп-буфер: 300 мМ ЭДТА, рН 8,0
• 10 х dNTP: по 200 мкМ каждого из трифосфатов (dATP, dGTP, dТТР) в ТЭ,рН8,0
• ДНКаза I: 100-500 пг/мкл
• ДНК-полимераза I: 2 ЕД/мкл
• dCTP (удельная радиоактивность > 3000 Ки/ммоль, 110 ТБк/ммоль, 10 мкКи/мкл)

двухцепочечная днк

Методика
1. В помещенную в лед микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл вносят следующие реактивы:
• ДНК 50-500 нг
• 10 х НК-буфер 5мкл
• 10 х dNTP 5мкл
• Вода до конечного объема 50 мкл
• dCTP 5 мкл
• ДНКаза1 2 мкл (0,4-1,0 нг/мкг ДНК)
• ДНК-полимераза I 2 мкл (4 ЕД)

Перемешивают все компоненты аккуратным встряхиванием пробирки и центрифугируют смесь при 12 000 g в течение 2 с, осаждая содержимое пробирки на дно.

2. Помещают пробирку в водяную баню на 15 С примерно на 2 ч,
3. Останавливают реакцию, добавив 5 мкл стоп-буфера, и не-включившиеся нуклеотиды удаляют переосаждением этанолом или хроматографией на сефадексе.
4. Перед проведением гибридизации зонд денатурируют, прогревая в течение 5 мин при температуре 95—100 °С, затем в течение 5 мин охлаждают во льду. После этого зонд можно хранить при —20 °С в течение нескольких суток.

Б. Нерадиоактивное мечение Материалы
Для биотина:
• 10 х dNTP: по 200 мкМ каждого из трифосфатов (dGTP, dCTP, dTTP)BT3,pH8,0
• Bio-7-dATP: 0,4 мМ

Для дигоксигенина:
• 10 х dNTP: по 200 мкМ каждого из трифосфатов (dATP, dGTP, dTTP) и 130 мкм dTTP вТЭ, рН 8,0
• Dig-11-dUTP: 1мМ

Методика
1. В находящуюся во льду микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл вносят следующие реактивы:
• ДНК 1 мкг 10 х НК-буфер 5 мкл
• l0 x dNTP 5 мкл
• Вода до конечного объема 50 мкл
• 0,4 мМ bio-7-dATP 2,5 мкл или 1,0 м М dig-11 -dUTP 1 мкл
• ДНКаза I 2 мкл (0,4-1,0 нг/мкг ДНК)
• ДНК-полимераза I 2 мкл (4 ЕД)

2. Перемешивают все компоненты аккуратным встряхиванием пробирки и центрифугируют при 12 000 g в течении 2 с, собирая содержимое пробирки на дне. Проводят все операции, описанные в протоколе для радиоактивного мечения зондов, начиная с п. 2. Разлитый на небольшие аликвоты раствор меченого зонда можно хранить при -70 °С в течение нескольких месяцев, но рабочий раствор хранят при 4 °С.

Метод ник-трансляции непригоден для мечения одноцепочеч-ной ДНК, но одинаково эффективен в случае линейной и кольцевой двухцепочечной ДНК. Число вносимых в ДНК разрывов, а следовательно, и размер получаемых одноцепочечных меченых фрагментов зависит от концентрации ДНКазы I. Описанный выше метод позволяет получать меченые одноцепочечные фрагменты длиной 200—500 нуклеотидов, оптимальной для гибридизации на фильтрах.
В первые часы реакции включение радиоактивной метки линейно зависит от времени инкубации.

- Читать далее "Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки"

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: