Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение

РНК-зонды имеют ряд преимуществ по сравнению с двухцепочечными ДНК-зондами, полученными методами ник-трансляции или рассеянной затравки. К таким преимуществам относятся высокая удельная радиоактивность (1-109 имп./мин на 1 мкг), отсутствие гибридизации между самими зондами, точно известный размер. Эти зонды можно использовать в тех же случаях, что и ДНК-зонды, причем более высокая термостабильность гибридов РНК—РНК по сравнению с гибридами РНК—ДНК повышает чувствительность метода, а возможность расщепить непрогибри-дизовавшуюся (одноцепочечную) РНК РНКазой А позволяет существенно снизить фон и получить высокое отношение сигнал/шум.

РНК-зонды используются и в более специальных экспериментах: при РНКазном картировании (определении положения концов молекулы-мишени), в опытах по трансляции in vitro, для специфического блокирования экспрессии генов антисмысловыми РНК.

Синтез коротких одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) химическими методами с помощью автоматических синтезаторов является сейчас рутинной процедурой. Простота получения олигонуклеотидов с определенной последовательностью позволяет использовать их в различных целях: в качестве праймеров при секвенироании ДНК, как зонды для выявления методом гибридизации по Саузерну специфических групп генов, отдельных генов и даже точковых мутаций в определенных аллелях.

Чаще всего применяют три типа олигонуклеотидных зондов: олигонуклеотиды с четко определенной последовательностью, пулы коротких олигонуклеотидов с сильно «вырожденными» последовательностями и пулы более длинных олигонуклеотидов с менее «вырожденными» последовательностями.

рнк зонды

Олигонуклеотиды со строго заданной последовательностью синтезируют как фрагмент последовательности клонированного участка ДНК, и такие олигонуклеотиды полностью комплементарны последовательности мишени. Обычно их длина составляет от 19 до 40 нуклеотидов, и при гибридизации в правильно подобранных условиях они могут отличать последовательность мишень от других, близкородственных ей последовательностей. Такие олигонуклеотиды используются для скрининга библиотек кДНК и геномных ДНК с целью выявления клонов, содержащих фрагменты ДНК, перекрывающиеся с ранее клонированными последовательностями.

Нуклеотидные последовательности коротких вырожденных олигонуклеотидов можно найти, определив аминокислотные последовательности коротких полипептидов секвенированием микроколичеств (пикомоли) высокоочищенных белков. Вследствие вырожденности генетического кода обычно приходится синтезировать несколько олигонуклеотидов, соответствующих всем возможным вариантам кодирования данной аминокислотной последовательности. Пул таких вырожденных олигонуклеотидов можно использовать в качестве набора гибридизационных зондов для получения клонов-кандидатов, из которых потом можно отобрать клон, несущий тот ген, который нас интересует.

Этот подход с успехом использовался для получения как кДНК, так и геномных клонов. Размер вырожденных олигонуклеотидов в таком пуле составляет 17—20 нуклеотидов, так что они являются достаточно длинными для обеспечения специфической гибридизации с искомым геном и в то же время слишком короткими для образования неправильных гибридов с негомологичными последовательностями, которые детектировались бы гибридизационными методами.

Длинные (30-70 звеньев) олигонуклеотиды с меньшей степенью вырожденности тоже находят достаточно широкое применение, поскольку эффект неправильного спаривания с избытком компенсируется теми преимуществами, которые дает образование длинных стабильных гибридов.

- Читать далее "Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4"

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: