Мечение с использованием фрагментов, полученных с помощью электрофореза в легкоплавком агарозном геле
1. Проводят электрофорез фрагментов ДНК в легкоплавком агарозном геле (трис-ацетатный буфер), содержащем бромистый этидий в концентрации 0,5 мкг/мл (NB! Бромистый этидий — сильный канцероген), Вырезают кусочек геля с нужным фрагментом (в нем должно содержаться не менее 250 нг ДНК).
2. Переносят его в предварительно взвешенную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл.

3. Добавляют воду из расчета 3 мл на 1 г агарозного геля и помещают пробирку в кипящую воду на 7 мин для расплавления агарозы и денатурации ДНК.
4. Помешают пробирку не менее чем на 10 мин в водяную баню на 37 °С.
5. В чистую пробирку, содержащую все компоненты для проведения стандартного мечения методом рассеянной затравки, переносят водно-агарозный раствор, содержащий 25 нг ДНК. Если объем этого раствора превышает 10 мкл, то увеличивают объем реакционной смеси до 50 мкл, добавив воду. Во время инкубации возможно образование геля, но реакция удлинения будет идти и в этом случае.

При той концентрации изотопной метки, которая указана в протоколе, и при уровне включения 65-75% удельная радиоактивность продукта составляет 1,0 * 10⁹ имп./мин на 1 мкг. если используется 25 нг матрицы. В качестве метки можно применять и другие радиоактивно меченные нуклеотиды, но удельная радиоактивность при этом будет значительно ниже. Так, при том же коли честве матрицы, но мечении с помощью dATP удельная радиоактивность продукта составит примерно 7,7 • I08 имп./мин на 1 мкг.

По данным электрофореза в щелочных агарозных гелях, полученные методом рассеянной затравки радиоактивно меченные зонды обычно имеют длину 400—600 нуклеотидов. 32Р-зонды с высокой удельной радиоактивностью подвергаются быстрому радиолизу, и при хранении в течение даже 24 ч их средний размер значительно уменьшается.

Фрагменты ДНК, полученные при разделении с помощью электрофореза в легкоплавком агарозном геле, можно использовать для синтеза зондов, меченных биотином или дигоксигени-ном. Эти метки включаются в новосинтезированную ДНК через каждые 20—25 нуклеотидов, так что чувствительность их детекции может быть очень высокой. Размер меченых фрагментов составляет 200-2000 п. н.

Получение зондов с помощью полимеразмой цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет получать in vitro большое число копий специфических фрагментов ДНК, располагая малым количеством сложной и часто загрязненной матрицы. Если в ПЦР-реакции используются меченые трифосфаты, то амплифицированная ДНК (размер которой варьирует от 180 п.н. до 2 т.п.н.) может иметь высокую удельную радиоактивность: ~ 5 • 109 имп./мин на 1 мкг. Это больше, чем дают методы ник-трансляции и рассеянной затравки.

Зонды, получаемые методом ник-трансляции, обычно имеют удельную радиоактивность 0,5 - 109 имп./мин на 1 мкг, но эффективность мечения снижается, если размер используемых фрагментов ДНК становится меньше 1 т.п.н. Для метода рассеянной затравки удельная радиоактивность зонда составляет 2 • 109 имп./мин на 1 мкг, но и в этом случае эффективность мечения снижается для фрагментов, размер которых находится вне диапазона 0,5-2 т.п.н. Таким образом, метод ПЦР оказывается особенно ценным, когда требуется получить зонды с высокой удельной радиоактивностью, располагая субнанограмовыми количествами ДНК-матрицы размером менее 500 п.н. При необходимости путем частичной замены меченых нуклеотидов «холодными» (немечеными) трифосфатами методом ПЦР можно получить зонды и с более низкой удельной радиоактивностью. Для получения полноразмерной копии ДНК-матрицы все четыре нуклеотида должны присутствовать в реакционной смеси в эквимолярных количествах.

Обычно используемые для ПЦР-мечения матрицы уже были переклонированы в каком-либо векторе. Это позволяет с помощью ограниченного числа праймеров, комплементарных участкам, соседствующим с сайтом инсерции ДНК-матрицы в векторе, получить большое число зондов, комплементарных различным клонированным фрагментам ДНК. Недавно метод ПЦР использовали и для получения меченых зондов путем непосредственной амплификации геномной ДНК.

К 5-концу олигонуклеотидного праймера можно присоединить последовательность, не комплементарную матрице. При ПЦР эта последовательность будет встроена в двухцепочечный продукт, и если она представляет собой промотор, узнаваемый РНК-полимеразой, то амплифицированный фрагмент можно будет транскрибировать с использованием ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Это позволяет получить меченый РНК-транскрипт без переклонирования фрагмента ДНК под контроль фагового промотора.

- Читать далее "Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР"