Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов

А. Радиоактивное мечение
Материалы
• 10 х транскрипционный буфер (10хТБ): 400 мМ трис-HCl, рН 7,5, 60 мМ MgCl2, 10 мМ спермидин
• 10 х rNTP: по 5 мМ гАТР, гСТР, rGTP, рН 7,5, 250 мкМ rUTP, рН7,5
• UTP (удельная радиоактивность 400-3000 Ки/ммоль)
• 100 мМДТТ
• Плацентарный ингибитор рибонуклеаз (РНКазин): 40 ЕД/мкл
• Полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ: 10—20 ЕД/мкл
• ДНК-матрица, линеаризованная разрезанием с 3 -стороны от фагового промотора (0,1-1,0 мкг)

Методика
1. В микроцентрифужную пробирку вносят в указанном порядке следующие реактивы:
• 10хТБ 5мкл
• 100 мМ ДТТ 5мкл
• РНКазин 1,5 мкл (примерно 80 ЕД)
• 10 x rNTP 5 мкл
• Вода 26,5 мкл
• ДНК-матрица 1 мкл (примерно0,1—1,0 мкг)
• UTP 5 мкл (эквивалентно 12,5 мкМ)
• РНК-полимераза 1 мкл (10-20 ЕД)

получение рнк зондов

2. Инкубируют смесь при 37 °С в течение 1 ч (в случае РНК-поли-мераз ТЗ и Т7) и в течение 2 ч (в случае РНК-полимеразы SP6).
3. Необязательный этап: разрушают ДНК-матрицу, обработав ее в течение 15 мин при 37 °С свободной от РНКаз ДНКазой (1 ЕД), и очищают зонд, как это описано в протоколе, добавив равный объем смеси фенол : хлороформ (1:1, о/о). Невключившиеся меченые нуклеотиды удаляют хроматографией на сефадексе.
4. Переосаждают РНК, как это описано в протоколе, и растворяют ее в 100 мкл обработанной ДЭПК воды.

Б. Нерадиоактивное мечение
Материалы
Те же, что и выше, со следующими изменениями:
• 10 х ТБ: 400 мМ трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ MgCl2) 20 мМ спермидин, 100 мМ ДТТ, 100 мМ NaCl
• 10xdig-rNTP: по 10 мМ гАТР, rCTP, rGTP, 6,5 мМ rUTP/3,5 мМ dig-UTP, рН 7,5
или
• 10 х biо-rNTP: по 10 мМ rАТР, rCTP, rGTP, 6,5 мМ rUTP/3,5 мМ bio-UTP,pH7,5

Методика
1. В микроцентрифужную пробирку, помешенную в лед, вносят следующие реактивы:
• 10хТБ 2 мкл
• Вода 12 мкл
• РНКазин 1 мкл
• Линеаризованная ДНК-матрица 1 мкл (1 мкг)
• 10 х dig-rNTP ил и 10 х bio-rNTP 2 мкл
• РНК-полимераза 2 мкл (40 ВД)

2. Инкубируют смесь при 37 °С в течение 1 ч (в случае РНК-поли-мераз Т3 и Т7) и в течение 2 ч (в случае РНК-полимеразы SP6).
3. Останавливают реакцию, добавив 0,2 М ЭДТА, рН 8,0, и переосаждают РНК этанолом, как описано в протоколе (но вместо ацетата калия используют хлористый литий). Растворяют РНК в 100 мкл обработанной ДЭПК воды.
К протоколу необходимо сделать следующие замечания.

а. ДНК-матрицу необходимо добавлять только после разбавления 10 х ТБ, содержащего спермидин в концентрации 20 мМ. При концентрации спермидина > 4 мМ ДНК может выпасть в осадок.
б. Скорость включения в РНК bio-UTP с помошью РНК-полимеразы SP6 очень мала, поэтому следует использовать РНК-полимеразы ТЗ и Т7.
в. Эффективность фенольной очистки меченной дигоксиге-нином РНК очень мала вследствие частичного перехода меченой РНК в органическую фазу, так что этот этап следует опустить.

Если для гибридизации in situ или на фильтрах необходимы зонды с очень высокой удельной радиоактивностью и если при этом образование полноразмерных РНК-транскриптов не является абсолютно необходимым, то можно полностью исключить из реакции «холодный» rUTP и уменьшить объем реакционной смеси до 10 мкл. Максимальной удельной радиоактивности зонда можно достичь, если проводить мечение в объеме 20 мкл и использовать 100 мкКи UTP с удельной радиоактивностью 400 Ки/ммоль. Конечная концентрация UTP в реакционной смеси составляет при этом 12,5 мкМ.

В тех случаях, когда после гибридизации in situ необходимо определить клеточную локализацию сигнала, лучше использовать в качестве метки изотоп 35S, позволяющий получить более высокое разрешение, чем 32Р.

Для выявления мРНК в архивных биоптатах с успехом использовались нерадиоактивно меченные РНК-зонды (J. С. Martinez-Monlero, в печати). Эти зонды можно хранить при —20 С, не опасаясь деградации РНК, более двух лет, что значительно превышает время полудеградации зондов, меченных 32Р и 3SS.

- Читать далее "Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение"

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: